桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法

本发明属于微生物学、生物技术和生物防治，涉及桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法。

背景技术：

1、安吉菌素（andrimid）是一种非核糖体肽-聚酮抗生素，在过去的二十年中研究已发现多种不同的细菌分泌产生安吉菌素，包括成团泛菌 ( pantoeaagglomerans),普城沙雷菌 (serratia plymuthica), 以溶珊瑚弧菌 ( vibriocoralliilyticus)等。安吉菌素是细菌催化脂肪酸生物合成的第一步的酶-乙酰辅酶a羧化酶的纳米摩尔抑制剂，抑制该酶可以阻断原核脂肪酸生物合成的步骤。体外实验和计算机模拟发现其类药性评分较高，无系统性毒性，有望广泛应用于生物农药、兽药及医药等领域。

2、目前，桃色欧文氏菌首次被报道可产生安吉菌素，因此关于其发酵条件的研究仍是空白。但matilla等人在2016年对碳氮源及温度对普城沙雷菌菌株a153产安吉菌素做了系列研究，发现在4-20℃下能够稳定产生安吉菌素，但在30℃下则检测不到，且仅局限于三角摇瓶体系中。giuubergia等人发现了添加甲壳素可提高以溶珊瑚弧菌菌株 s2052安吉菌素的产量。但桃色欧文氏菌与上述两种菌株差异较大，不能直接借鉴二者的培养方法。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

2、因此，桃色欧文氏菌的发酵条件应结合菌种本身特性及安吉菌素基因簇特征进行特异性优化，以致力于获得安吉菌素最佳产量。

3、本发明的一个目的是提供一种最优的发酵方式用于获得最高产量的安吉菌素，该方法可在摇瓶体系到5 l发酵罐体系下进行。该发酵方式适用于具有产安吉菌素功能的桃色欧文氏菌菌株。

4、为此，本发明提供的技术方案为：

5、桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，包括如下步骤：

6、1）将桃色欧文氏菌（ erwiniapersicina）接种于液体培养基中进行培养，获取发酵液，其中，培养中，发酵温度为15-20℃，发酵时间为9-45小时，液体培养基中包含碳源、氮源和无机盐，所述碳源为柠檬酸钠和/或葡萄糖酸钠，所述氮源为酵母提取物、牛肉膏和/或胰蛋白胨，作为优选，所述无机盐为氯化钠。

7、2）从步骤1）中生长的发酵液中收集安吉菌素。

8、优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，所述桃色欧文氏菌采用桃色欧文氏菌2022tibbst187菌株（简称bst187），所述桃色欧文氏菌2022tibbst187菌株的分类命名：桃色欧文氏菌 erwiniapersicina，菌株桃色欧文氏菌 erwiniapersicina2022tibbst187被保藏在中国典型培养物保藏中心（简称cctcc），保藏号为：cctcc no：m 2022872，保藏时间为：2022年06月13日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

9、优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，步骤1）中，所述液体培养基以柠檬酸钠为碳源，以牛肉膏为氮源，以氯化钠为无机盐。最优发酵培养基为柠檬酸钠20g/l，牛肉膏5 g/l和氯化钠 10g/l。

10、优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，步骤1）中，发酵初始ph为6-7，发酵过程中调节ph保持6-7，适宜的最终ph为6.8-7.8。作为优选，发酵过程最好将ph稳定在7左右。

11、优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，步骤1）中，培养在5 l发酵罐中进行，且在发酵过程中维持doi高于30%。高溶氧可以显著提高bst187的菌体生物量。

12、优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，步骤1）中，所述桃色欧文氏菌的种子液的接种量为1%-3%。最优选接种量为1%。

13、优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，还包括如下步骤：首先，取出保存的桃色欧文氏菌菌株的菌种，于lb固体培养基上划线活化，28℃培养箱过夜培养，然后，将活化出来的单菌落接种于5 ml lb液体培养基中，28℃、200 rpm摇培过夜得到所述种子液。当然，作为优选，也可使用最优发酵培养基（柠檬酸钠20 g/l，牛肉膏5 g/l和nacl 10g/l）、温度15-20℃下进行生产种子液。

14、本发明至少包括以下有益效果：

15、本发明提供一株桃色欧文氏菌抑菌物质安吉菌素（andrimid）的发酵培养基和发酵条件的优化方法，本发明采用液体发酵方法，发酵时间为12-24 h、接种量1%、初始和发酵ph为6.5-7.5、维持高溶氧水平、温度为15-20℃。以最优发酵条件，5 l发酵罐发酵生产，将发酵上清液经80%硫酸铵沉淀、甲醇溶解后的安吉菌素粗提物纯度在40%-60%，浓度约为10.73 g/l，比原始发酵条件提高了3.1倍，所需成本仅为最初1/3，操作过程简化，极大的节省了人力物力。

16、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

技术特征：

1.桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，其特征在于，步骤1）中，所述液体培养基以柠檬酸钠为碳源，以牛肉膏为氮源，以氯化钠为无机盐。

3.如权利要求1所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，其特征在于，步骤1）中，发酵温度为15-20℃。

4.如权利要求1所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，其特征在于，步骤1）中，发酵时间为12-24小时。

5.如权利要求1所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，其特征在于，步骤1）中，发酵初始ph为6-7，发酵过程中调节ph保持6-7。

6.如权利要求1所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，其特征在于，步骤1）中，培养在5 l发酵罐中进行，且在发酵过程中补充氧气，使溶氧do保持在30%v/v以上。

7.如权利要求1所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，其特征在于，步骤1）中，所述桃色欧文氏菌的种子液的接种量为1%-3%。

8.如权利要求1所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，其特征在于，所述桃色欧文氏菌采用桃色欧文氏菌2022tibbst187菌株，所述桃色欧文氏菌2022tibbst187菌株的分类命名：桃色欧文氏菌erwinia persicina，菌株桃色欧文氏菌erwinia persicina2022tibbst187被保藏在中国典型培养物保藏中心（简称cctcc），保藏号为：cctcc no：m2022872，保藏时间为：2022年06月13日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

9.如权利要求7所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，其特征在于，还包括如下步骤：首先，取出保存的桃色欧文氏菌菌株的菌种，于lb固体培养基上划线活化，28℃培养箱过夜培养，然后，将活化出来的单菌落接种于5 ml lb液体培养基中，28℃ 、200 rpm摇培过夜得到所述种子液。

技术总结
本发明公开了一种桃色欧文氏菌产安吉菌素（andrimid）的方法，包括：1）将桃色欧文氏菌接种于液体培养基中进行培养，获取发酵液，其中，培养中，发酵温度为15‑20℃，发酵时间为12‑24小时，液体培养基中包含碳源、氮源和无机盐，所述碳源为柠檬酸钠和/或葡萄糖酸钠，所述氮源为酵母提取物、牛肉膏和/或胰蛋白胨，所述无机盐为氯化钠；2）从步骤1）中生长的发酵液中收集安吉菌素。本发明得到的安吉菌素粗提物纯度在40%‑60%，产量比原始发酵条件提高了3.1倍，所需成本仅为最初1/3，操作过程简化，极大的节省了人力物力。

技术研发人员：赵磊,葛同玲,程庭峰,赵伦强,侯余勇
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11