细菌核酸提取性能指标评价方法、组合物及试剂盒

本发明涉及微生物检测，特别涉及一种细菌核酸提取性能指标评价方法、组合物及试剂盒。

背景技术：

1、高度敏感的核酸检测技术，如广泛使用的pcr，已成为检测微生物病原体的主要分子诊断工具。然而，与所有新的生物标记物一样，样品分析物浓度的准确测定取决于分析物回收过程的可重复性和效率。样品存储方法、分离方法和操作技术的可变性可能会影响核酸的回收效率，导致在核酸定量中引入伪影，影响随后的临床决策。核酸提取效率，是指提取后与提取前的核酸拷贝数的比值。获取准确的核酸提取效率是至关重要的，它可以抵消不同操作、协议和样本收集方法之间的差异所带来的核酸提取效率的可变性，从而使不同实验测得的核酸结果更具可比性。然而，细菌核酸在提取前是完全被包裹在细菌内部的，无法直接测定拷贝数。目前常见的核酸提取效率评价方法，多采用横向对比方法，利用不同提取方法对同一份样品进行提取并分别测量提取后的核酸拷贝数，来比较不同方法的提取效率的高低。但是这个方法只能得到一个相对的结果，无法真正计算方法的提取效率。还有研究使用核酸标准品取代细菌进行评价，即使用待评价的方法对核酸标准品进行一次提取操作，并通过测量提取过程中的核酸损失量来间接计算提取效率。然而该方法忽视了实际提取操作中，细菌裂解效率对提取效率的影响，使得评价结果不准确。

2、目前检测目标微生物核酸的核酸检测技术通常包含用作内质控的非目标核酸，以验证每个扩增和/或检测反应的效率。许多不同的策略已用于构建用于分子诊断分析的最佳内质控核酸模板。伴随扩增和/或检测这样的内质控核酸模板允许验证核酸检测技术性能。在没有测定抑制的情况下，内质控模板应从目标微生物核酸阴性的测试样品中有效检测。用对目标微生物核酸呈阴性的测试样品观察到的缺失或低内质控检测信号表明测试样品对核酸测定的完全或部分抑制，其可能含有核酸扩增和/或检测的抑制剂。试剂或仪器级别的技术故障可能也阻止ic核酸模板的正常扩增。然而，这些内质控不允许验证测试样品制备、细胞裂解和核酸提取程序的效率，因为它们仅基于添加到每个核酸测定反应中的目标核酸模板的检测。因此，它们只能揭示核酸扩增反应存在的问题。

3、许多微生物物种具有坚固的细胞壁(例如，革兰氏阳性菌、分枝杆菌、细菌孢子和酵母)，这使得它们难以裂解。任何目标微生物细胞的有效裂解都需要释放其核酸并允许扩增和/或检测目标核酸。事实上，核酸检测技术的最佳测试样品制备程序必须有效地从任何目标微生物细胞或病毒中释放核酸，并对其进行处理，以消除、中和或灭活测试样品中可能存在的核酸酶和抑制物质。因此，还必须验证核酸分析的样品制备和核酸提取程序，以确保其对目标的充分性能微生物细胞裂解和核酸回收。考虑到有效的微生物细胞裂解和目标核酸回收是分子方法检测微生物病原体的两个关键先决条件,有必要开发一种核酸提取性能评价方法，同时验证微生物裂解和核酸回收效率,从而更精确的评估细菌核酸提取效率。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种细菌核酸提取性能指标评价方法、组合物及试剂盒。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种细菌核酸提取性能指标评价方法，该性能指标至少包括核酸提取效率、核酸回收效率和细胞裂解效率，该方法包括以下步骤：

3、s1、核酸提取效率评价：

4、s1-1、将细菌孢子作为评价样本，取细菌孢子均分为两份，分别记为样本1和样本2；

5、s1-2、用待评价的核酸提取方法提取样本1中的细菌基因组dna；

6、s1-3、对细菌基因组dna进行pcr扩增，通过数字pcr检测得到步骤s1-2提取的细菌基因组dna的核酸拷贝数cd；

7、s1-4、测定样本2中的孢子数，并转换得到样本2中的细菌基因组dna拷贝数cr；

8、s1-5、通过以下公式计算得到待评价的核酸提取方法的核酸提取效率r1：

9、r1＝cd/cr；

10、s2、核酸回收效率评价：

11、s2-1、使用相同的dna提取试剂盒分别提取等量的两份所述细菌孢子的细菌基因组dna，得到的一份细菌基因组dna通过数字pcr检测得到该细菌基因组dna的核酸拷贝数cp，另一份作为纯化基因组dna；

12、s2-2、取与所述步骤s2-1中的细菌孢子等量的另一部分细菌孢子均分为两部分，分别记为样本a和样本b，样本a中加入步骤s2-1中的纯化基因组dna，样本b中加入与该纯化基因组dna等体积的缓冲液；

13、s2-3、用待评价的核酸提取方法分别提取步骤s2-2得到的样本a和样本b中的细菌基因组dna拷贝数，依次记为c1和c2；

14、s2-4、通过以下公式计算得到待评价的核酸提取方法的核酸回收效率r2：

15、r2＝(c1-c2)/cp；

16、s3、细胞裂解效率评价：

17、通过以下公式计算得到待评价的核酸提取方法中的细胞裂解效率rl：

18、rl＝r1/r2。

19、优选的是，所述细菌孢子为萎缩芽孢杆菌孢子。

20、优选的是，所述萎缩芽孢杆菌孢子通过以下方法制备得到：

21、将萎缩芽孢杆菌菌株cicc-10377于37℃下在含蛋白胨、牛肉提取物、nacl和mnso4的琼脂培养基上生长24小时，然后通过溴化钠纯化，得到所述萎缩芽孢杆菌孢子。

22、优选的是，所述萎缩芽孢杆菌孢子的纯度＞99.9％。

23、优选的是，所述步骤s1-4中采用平板计数的方法测定样本2中的孢子数。

24、本发明还提供一种细菌核酸提取性能指标评价组合物，其包括萎缩芽孢杆菌孢子、纯化基因组dna以及用于检测萎缩芽孢杆菌的引物和探针，所述纯化基因组dna为采用dna提取试剂盒提取得到的萎缩芽孢杆菌孢子的dna；该组合物用于通过如上的方法对细菌核酸提取方法的性能指标进行评价。

25、优选的是，所述引物包括由seq id no:1所示的正向引物和由seq idno:2所示的反向引物；

26、优选的是，所述探针的核酸序列如seq id no:3所示，所述探针的5’端标记fam、hex或vic基团，3’端标记bhq1或bhq2或mgb基团。

27、优选的是，所述组合物还包括pcr预混液。

28、本发明还提供一种细菌核酸提取性能指标评价试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如上所述的萎缩芽孢杆菌孢子、纯化基因组dna、用于检测萎缩芽孢杆菌的引物和探针以及pcr预混液，该试剂盒用于通过如上所述的方法对细菌核酸提取方法的性能指标进行评价。

29、本发明的有益效果是：

30、本发明提供的细菌核酸提取性能指标评价方法、组合物及试剂盒可以同时评价细菌裂解效果和核酸回收效率，可根据细菌裂解效果和核酸回收效率对核酸提取试剂评价并针对性改进。此外，本发明采用的数字pcr方法可以更精确的评估细菌核酸提取效率，抵消不同操作和样本收集方法之间的差异所带来的核酸提取效率的可变性，从而使不同实验测得的核酸结果更可比性。