本发明属于生物,尤其涉及laci突变体及其应用。
背景技术:
1、作为研究最深入广泛的微生物,大肠杆菌具有两个显著特征:操作简单和能在廉价培养基中实现高密度培养,因此大肠杆菌表达系统是高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多优点,但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mrna的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因、在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等。
2、乳糖启动子(lac)是大肠杆菌中最早发现、应用最为广泛的启动子。其工作机制是当无有小分子诱导物(如乳糖及其类似物)时调控蛋白laci结合于操纵基因laco,从而阻遏转录起始;而当诱导物存在时,可与laci蛋白相结合,从而从laco序列解离,开启转录。乳糖启动子也衍生出tac、trc等启动子,并参与构建t7高表达系统。但lac系列启动子的问题之一在于不加入诱导剂(如异丙基硫代半乳糖苷(iptg))时,该系统的本底渗漏表达较高。这一缺点可能造成宿主细胞代谢负担,不利于异源蛋白尤其是毒性蛋白的表达。而利用该系统构建代谢通路时,渗漏表达将导致对代谢流的不精准调控,造成胞内资源的浪费,不适用于优化代谢模块配比。
3、现有的方式是通过突变laci调控蛋白启动子区,获得启动强度提升的laciq突变体,可显著降低本底渗漏表达。但laci蛋白本身固有特性,如与laco dna序列结合等特性,不是仅仅通过增加其表达量即可解决的。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于提供一种laci突变体,所述laci突变体的氨基酸序列如seq id no.2、3或4所示。
2、本发明的目的之二在于提供一种表达盒,所述表达盒含有上述laci突变体。
3、本发明的目的之三在于提供一种表达载体,所述表达载体含有上述laci突变体或表达盒。
4、进一步地,所述表达载体为重组质粒。
5、更进一步地,所述重组质粒为pet-22a(+)、pet-22b(+)、pet-3a(+)、pet-3d(+)、pet-11a(+)、pet-12a(+)、pet-14b、pet-15b(+)、pet-16b(+)、pet-17b(+)、pet-19b(+)、pet-20b(+)、pet-21a(+)、pet-23a(+)、pet-23b(+)、pet-24a(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28a(+)、pet-29a(+)、pet-30a(+)、pet-31b(+)、pet-32a(+)、pet-35b(+)、pet-38b(+)、pet-39b(+)、pet-40b(+)、pet-41a(+)、pet-41b(+)、pet-42a(+)、pet-43a(+)、pet-43b(+)、pet-44a(+)、pet-49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-1、pgex-6p-1、pgex-6p2、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-8、puc-18或puc-19。
6、本发明的目的之四在于提供一种重组宿主细胞,所述重组宿主细胞含有上述laci突变体。
7、进一步地,所述重组宿主细胞为大肠杆菌bw25113δlaci、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌或枯草芽孢杆菌。
8、本发明的目的之五在于提供一种增强目的基因表达的方法,所述方法包括将上述laci突变体与目的基因可操作地连接。
9、本发明的目的之六在于提供上述laci突变体在制备生物传感器中的应用。
10、与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
11、本发明在laciq突变体基础上,通过定向进化筛选获得laci调控蛋白突变体,该突变体可增强与dna序列结合能力,从而降低本底渗漏表达(低于野生型渗漏表达的5%)。
1.一种laci突变体,其特征在于,所述laci突变体的氨基酸序列如seq id no.2、3或4所示。
2.一种表达盒,其特征在于,所述表达盒含有权利要求1所述的laci突变体。
3.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体含有权利要求1所述的laci突变体或权利要求2所述的表达盒。
4.根据权利要求3所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体为重组质粒。
5.根据权利要求4所述的表达载体,其特征在于,所述重组质粒为pet-22a(+)、pet-22b(+)、pet-3a(+)、pet-3d(+)、pet-11a(+)、pet-12a(+)、pet-14b、pet-15b(+)、pet-16b(+)、pet-17b(+)、pet-19b(+)、pet-20b(+)、pet-21a(+)、pet-23a(+)、pet-23b(+)、pet-24a(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28a(+)、pet-29a(+)、pet-30a(+)、pet-31b(+)、pet-32a(+)、pet-35b(+)、pet-38b(+)、pet-39b(+)、pet-40b(+)、pet-41a(+)、pet-41b(+)、pet-42a(+)、pet-43a(+)、pet-43b(+)、pet-44a(+)、pet-49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-1、pgex-6p-1、pgex-6p2、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-8、puc-18或puc-19。
6.一种重组宿主细胞,其特征在于,所述重组宿主细胞含有权利要求1所述的laci突变体。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞,其特征在于,所述重组宿主细胞为大肠杆菌bw25113δlaci、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌或枯草芽孢杆菌。
8.一种增强目的基因表达的方法,其特征在于,所述方法包括将权利要求1所述的laci突变体与目的基因可操作地连接。
9.权利要求1中所述的laci突变体在制备生物传感器中的应用。