痘病毒mRNA疫苗及用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种痘病毒mrna疫苗及用途。

背景技术：

1、痘病毒是一种包膜dna病毒，属于痘病毒科痘病毒属；一些痘病毒可感染人类，引起严重的疾病，甚至威胁人类生命；例如可感染人类的4种正痘病毒：天花病毒(varv)、猴痘病毒(mpxv)、牛痘病毒(cpxv)和痘苗病毒(vacv)。减毒痘苗病毒疫苗接种所提供的交叉保护使在人类历史上曾引起多次大流行的天花病毒从人群中灭绝，证实疫苗乃是防控病毒感染与传播的最有效手段之一。目前，全球仅有少数国家储备天花疫苗，用于应对天花或类似的正痘病毒疫情；猴痘病毒疫情的频频出现，再次引起对人用痘病毒疫苗研发的关注。

2、出于安全性与产量考虑，越来越多的关注集中到基因工程痘病毒疫苗的开发上，用于预防天花或猴痘病毒感染。痘苗病毒表面抗原a27、l1、a33和b5含有大量优质保守中和抗体表位，已被证实可被作为天花疫苗和猴痘病毒新型疫苗的候选抗原。通过诱导高水平交叉体液与细胞免疫提供体内保护，多抗原设计理论上可以极大降低病毒突变逃逸风险。

3、mrna疫苗作为一种新型疫苗类型，已被证实拥有在动物体内和人体内诱导良好体液免疫与细胞免疫的潜能，背后的免疫学机理是：mrna递送至细胞内后，可表达原始构象抗原，通过mhc-i/ii类递呈方式诱导细胞免疫，通过与b细胞相互作用，诱导一定体液免疫。相较于传统的疫苗制备技术，mrna技术的优势在于：在获得足够抗原信息的情况下，疫苗原型制备概念验证、工艺开发可缩短至数月，产量极高、生产周期较短，可满足大规模突发疫情的接种防控需求。

4、现有的基因工程候选痘病毒疫苗(亚单位/dna)未能诱导高水平均衡的体液免疫与细胞免疫；且常需要佐剂配伍和四抗原分开设计，增加了工艺开发的难度。

5、目前，尚需要开发新型痘病毒mrna疫苗。

技术实现思路

1、本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，通过将a27、l1、a33和b5通过合理的抗原组合设计，构建了一种痘病毒mrna分子，动物免疫结果显示，所述mrna分子具有良好的候选疫苗潜力，为痘病毒疫苗的开发提供一种创新思路。由此提供了下述发明：

2、本发明的一个方面涉及一种分离的mrna分子，其包含编码区，所述编码区编码目标蛋白，所述目标蛋白包含如下4个蛋白：

3、痘苗病毒表面抗原a27、l1、a33和b5；

4、其中，相邻的两个蛋白独立地为直接连接或通过相同或不同的linker连接。

5、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其中：

6、a27的氨基酸序列如seq id no:6所示，

7、l1的氨基酸序列如seq id no:7所示，

8、a33的氨基酸序列如seq id no:8所示，和/或

9、b5的氨基酸序列如seq id no:9所示。

10、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其中，所述目标蛋白中，a27、l1、a33和b5依次排列；

11、优选地，所述目标蛋白中，a27、linker、l1、linker、a33、linker和b5依次排列。

12、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其中，所述目标蛋白由a27、linker、l1、linker、a33、linker和b5依次排列组成。

13、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其中，linker的氨基酸序列如seq id no:10所示。

14、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其中，所述目标蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。

15、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其中，编码区的序列如seqid no:11所示。

16、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其还包含选自如下的一项或者多项：

17、5’utr、终止密码子、3’utr和polya；

18、优选地，所述分离的mrna分子依次包含：

19、5’utr、编码区、终止密码子、3’utr和polya。

20、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其由5’utr、编码区、终止密码子、3’utr和polya组成。

21、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其中：

22、5’utr的序列如seq id no:12所示，

23、终止密码子的序列为ugauaa，

24、3’utr的序列如seq id no:13所示，和/或

25、polya的序列如seq id no:14所示。

26、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的mrna分子，其序列如seq id no:1所示。

27、本发明中，如果没有特别说明，5’端帽子结构和kozak属于5’utr序列，即视为5’utr序列的一部分。

28、本发明的另一方面涉及一种分离的dna分子，其能够转录出本发明中任一项所述的分离的mrna分子。

29、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的dna分子，其包含seq id no:3或seqid no:4所示序列的dna片段。

30、本发明人发现，相对于seq id no:3所示序列的dna片段，seq id no:4所示序列的dna片段在体内或体外的蛋白表达水平更高。

31、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的dna分子，其还包含位于上游的启动子，优选为t7启动子。

32、在本发明的一些实施方式中，所述的分离的dna分子，其序列如seq id no:5所示。

33、本发明的再一方面涉及一种重组质粒，其包含本发明中任一项所述的分离的dna分子。

34、本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其包含本发明中任一项所述的分离的dna分子或者包含本发明的重组质粒。

35、本发明的再一方面涉及一种mrna疫苗制剂，包含本发明中任一项所述的分离的mrna分子，以及mrna疫苗载体；

36、优选地，所述mrna疫苗载体为脂质纳米颗粒或聚合物纳米颗粒；

37、优选地，所述脂质纳米颗粒；

38、优选地，mrna疫苗制的平均粒径为50-100nm、70-90nm、80-90nm或85nm；。

39、在本发明的一些实施方式中，所述的mrna疫苗制剂，其为用于预防天花或猴痘病毒感染的疫苗制剂。

40、本发明在再一方面涉及本发明中任一项所述的分离的mrna分子、本发明中任一项所述的分离的dna分子、本发明的重组质粒或者本发明的重组宿主细胞在制备预防天花或猴痘病毒感染的药物中的用途；优选地，所述药物为疫苗。

41、本发明的mrna疫苗可以参考如下步骤制备：

42、(1)基因克隆：将目的序列(例如seq id no:5)克隆进质粒载体中，经单克隆挑选和测序验证，获得包含目的基因的阳性克隆，阳性克隆菌株经发酵和质粒提取，获得环状质粒模板；

43、(2)体外转录(in vitro transcription,ivt)模板的制备：将环状质粒经限制性内切酶(例如bspqi)酶切线性化，将线性化质粒纯化，作为mrna合成起始模板；

44、(3)mrna的合成与纯化：以线性化质粒为模板，通过体外转录反应ivt合成目的mrna，经纯化获得高纯度的mrna分子；

45、(4)lnp-mrna脂质纳米颗粒复合物的制备与纯化：纯化的mrna原液和四种lnp(脂质纳米颗粒)经微流控设备混合，形成mrna-lnp复合物；mrna-lnp复合物经pbs稀释换液和超滤浓缩，获得mrna疫苗制剂。

46、发明的有益效果

47、本发明取得了如下技术效果(1)-(4)中的一项或者多项：

48、(1)本发明的mrna疫苗能够在体内诱导高水平的针对每一种vacv抗原(a27、a33、l1和b5)的特异性结合抗体，且在第二次免疫后针对四种抗原的抗体水平均获得明显提升。

49、(2)本发明的mrna疫苗能够在体内诱导高水平的针对每一种mpxv抗原(a29、a35、m1和b6)的交叉结合抗体，且在第二次免疫后抗体水平均获得明显提升。

50、(3)本发明的mrna疫苗能够诱导了明显的vacv中和抗体，且最终中和抗体滴度大于1000。

51、(4)本发明的mrna疫苗能够诱导特异性细胞免疫应答