一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒的制作方法

本技术涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种多重荧光pcr检测微卫星不稳定状态试剂盒。

背景技术：

1、微卫星(microsatellite，ms)序列，是一些短而重复的dna序列，一般由1～6个核苷酸组成，串联重复排列，常见类型为双碱基ca/ga/gt或单碱基a/t等。ms序列位于基因的重要非编码区，也可以位于基因的编码区，多态性分布于整个基因组，约占基因组3％。微卫星不稳定性(microsatellite instability，msi)是由于在dna复制时插入或缺失突变引起的微卫星(ms)序列长度改变的现象，常由错配修复功能(mismatch repair，mmr)缺陷引起。msi现象于1993年在结直肠癌中首次发现，随后在子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌等实体瘤中均有发生msi现象。msi是lynch综合征的特征性分子，约90％以上表现出msi。如果msi检测位点选择出现偏差，将直接影响微卫星高度不稳定(msi-h)患者的检出率，选择错误会大大增加漏诊率，会影响到千万个肿瘤患者的生命。目前国际公认的是「2b3d」panel，如果检测位点尚未经过人群验证，可能会造成假阴性或假阳性的结果。

2、目前国际上msi检测试剂盒是基于单核苷酸panel位点的检测，如promega开发的5个单核苷酸的panel(bat-25、bat-26、nr-21、nr-24、mono-27)。我国2021年胃癌指南的msi位点选择非常明确，5个位点的panel(2b3d的nci panel和5个单核苷酸的panel)，同年，《结直肠癌分子检测高通量测序专家共识》建议采用nci推荐的2b3d位点。中国人群使用2b3dnci panel比单核苷酸panel多检出近30％的msi-h肿瘤，因此，2b3d nci panel在中国人群中的广泛使用可避免msi-h肿瘤的漏检。无论是哪种panel，检测方法均为多重荧光pcr+毛细管电泳。

3、目前国内只有一款基于2b3d的检测试剂盒，但只有一个pentac的对照位点，其不足的地方在于一个对照位点不足以判断潜在的样品加错、样品污染。因为在多数情况下，对照位点的产物个数和大小一致(片段大小差异小于0.5nt)；少数情况下，由于样本存在微卫星不稳定，对照位点可能会表现不稳定，因此需要引入至少2个对照位点来核实检测样本是否为同一个体。

技术实现思路

1、为了解决以上技术问题，本技术提供了一种多重荧光pcr检测微卫星不稳定状态试剂盒，本技术除了2b3d位点和penta d对照位点外，还包含了性别位点，更加保障了检测的准确性。

2、本技术的技术方案如下：

3、一种多重荧光pcr检测微卫星不稳定状态试剂盒，包括如下引物：

4、第一标志物，bat-25，包含25个连续t的同聚物重复，其基因编号为x06182，s上下游引物为：

5、bat-25-f：5’gggagtgattctctaaagag 3’(seq id no.1)；

6、bat-25-r：5’tgacattctgcattttaactatgg 3’(seq id no.2)；

7、第二标志物，bat-26，包含26个连续a的同聚物重复，其基因编号为u04045，上下游引物为：

8、bat-26-f：5’gacttcagccagtatatgaaat 3’(seq id no.3)；

9、bat-26-r：5’cttcagtatatgtcaatgaaaacatt 3’(seq id no.4)；

10、第三标志物：d2s123，包含15个连续的ca同聚物重复，其基因编号为z16551.1，上下游引物为：

11、d2s123-f：5’gcctttaacagtgctattcaac 3’(seq id no.5)；

12、d2s123-r：5’acctatgggactgtgcatcta 3’(seq id no.6)；

13、第四标志物：d5s346，包含26个连续的ca同聚物重复，其基因编号为m73547.1，上下游引物为：

14、d5s346-f：5’tggcatatgaataccaggatag 3’(seq id no.7)；

15、d5s346-r：5’ctagtttttcagggaattgagag 3’(seq id no.8)；

16、第五标志物：d17s250，包含24个连续的ca同聚物重复，其基因编号为x54562.1，上下游引物为：

17、d17s250-f：5’gaaaaaagtaagcataaaaaggaag3’(seq id no.9)；

18、d17s250-f：5’gctggccatatatatatttaaacc3’(seq id no.10)；

19、对照位点：penta d，包含11个连续的aaaag同聚物重复，其基因编号为ap001752.1，上下游引物为：

20、penta d-f：5’ccaggcatggtgaggctg3’(seq id no.11)；

21、penta d-r：5’tgattctctttttttccccttcg3’(seq id no.12)；

22、性别位点：amel，对照标志物，其基因编号为ng_012040.1，上下游引物为：

23、amel-f：5’tgcgttaacaatgccctggg3’(seq id no.13)；

24、amel-r：5’ggaagctggtggtaggaact3’(seq id no.14)。

25、进一步的，所述标志物、对照位点和性别位点所对应的上下游引物中至少有一条引物添加荧光基团。

26、进一步的，当各标志物和位点的上游引物在5’端添加荧光基团，其选自fam蓝色荧光基团、hex绿色荧光基团或rox红色荧光基团中的一种。

27、进一步的，标志物bat-25、d17s250在上游引物的5’端分别添加fam荧光基团。

28、进一步的，标志物bat-26、penta d、amel上游引物的5’端分别添加hex荧光基团。

29、进一步的，标志物d5s346、d2s123上游引物的5’端添加rox荧光基团。

30、进一步的，各标志物、对照位点和性别位点的上下游引物浓度相同，各引物终浓度为：

31、bat-25 0.5μm

32、bat-26 0.75μm

33、d2s123 0.15μm

34、d5s346 0.25μm

35、d17s250 0.5μm

36、pentad 0.3μm

37、amel 0.15μm。

38、进一步的，其包括如下的组分：

39、dna聚合酶20μl/管

40、10x pcr反应液500μl/管

41、msi引物混合液200μl/管

42、无核酸酶纯水1ml/管

43、msi质控品1 20μl/管

44、msi质控品2 20μl/管

45、liz500 25μl/管。

46、对比国内外msi试剂盒，本技术提供的msi试剂盒成本较低，特异性好，灵敏度高。本试剂盒可鉴定肿瘤微卫星不稳定msi的状态，通过对2个单苷酸(bat-25、bat-26)和3个双核苷酸(d2s123、d5s346和d17s250)的重复位点进行pcr扩增，经毛细管电泳检测后在显示系统中分析，并与正常组织作对照，可鉴定结直肠癌患者中msi的状态。