一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对、试剂盒和方法与流程

本发明属于分子生物学应用，具体涉及一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对、试剂盒和方法。

背景技术：

1、阪崎克罗诺杆菌(cronobacter sakazakii)，以往也称阪崎肠杆菌，是兼性厌氧革兰氏阴性芽孢杆菌，存在于婴儿奶粉、婴儿谷物食品、肉、水、蔬菜等多种食品中。婴幼儿是阪崎克罗诺杆菌感染的高危人群。一旦婴儿遭遇此种细菌感染可能由此引发菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎等，相关疾病致死率高达40％-80％。阪崎克罗诺杆菌具有较强的增殖能力，对环境因素有较强的抗逆性，具有较高的耐热、耐酸碱和极强的耐干燥特性。因此建立阪崎克罗诺杆菌快速而特异性的检测方法，是有效预防和控制食品中该菌污染的关键所在。

2、传统的克罗诺杆菌检测方法是富集增菌培养后显色平板分离再进行生化鉴定。然而，这种检测方法存在着步骤繁琐、过程漫长等问题。因此，建立准确、灵敏、快速、特异的检测方法，在食品安全检测中可以发挥重要作用。目前，已发展起来多种快速检测方法，这些方法主要是聚合酶链式反应(pcr)技术、环介导等温法(lamp)技术和重组酶聚合酶扩增(rpa)技术。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)是2006年由英国twistdx公司研发的一种等温核酸扩增技术。

3、现有阪崎克罗诺杆菌的检测技术一般针对α-葡萄糖苷酶(glua)基因、外膜蛋白a(ompa)基因、16s rrna基因等。相较于其他食源性致病菌如沙门氏菌，阪崎克罗诺杆菌特异基因的基础研究不足。阪崎克罗诺杆菌各地流行株不同，基因变异快，常用的检测靶基因特异性不足，有必要挖掘新的特异靶基因，提高检测技术的特异性和广谱性。

技术实现思路

1、现有rpa检测技术一般针对阪崎克罗诺杆菌glua基因、ompa基因、16s rrna基因等，但阪崎克罗诺杆菌型别多，基因变异多，有必要挖掘新的特异靶基因，提升检测技术的特异性和广谱性。本发明的第一个目的在于提供一种特异性强的检测检测阪崎克罗诺杆菌的新靶标。

2、本发明基于比较基因组学系统地分析了阪崎克罗诺杆菌的特异基因，挖掘出新靶标糖基水解酶基因mngb，并提供了该基因中的一段核苷酸序列(靶基因片段)应用在检测阪崎克罗诺杆菌中，该靶基因片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、发明人发现，ncbi数据库中的所有阪崎克罗诺杆菌的二代、三代全基因组测序菌株mn gb都具有较高的同源性。阪崎克罗诺杆菌不同菌株ompa基因序列相似性最低只有96％左右，glua基因序列相似性最低只有97％左右，阪崎克罗诺杆菌不同菌株mngb基因序列相似性最低可达98％左右。相比ompa、glua基因而言，阪崎克罗诺杆菌不同菌株mngb同源性更高，因此本发明的方法在鉴别区分阪崎克罗诺杆菌上有优良的广谱性。

4、此外，阪崎克罗诺杆菌的mngb基因与其他近缘细菌如苏黎世克罗诺杆菌(c.turicensis)、丙二酸盐克罗诺杆菌(c.malonaticus)同源性很低。阪崎克罗诺杆菌的ompa、glua基因与其他近缘细菌同源性较高。本发明基于该靶基因片段的方法在鉴别区分阪崎克罗诺杆菌与其近缘物种上有优良的特异性。

5、基于上述新靶标的靶基因片段，本发明的第二个目的在于提供一种检测阪崎克罗诺杆菌的rpa引物对，所述引物对根据上述的靶基因片段设计得到，包括上游引物mngb-f和下游引物mngb-r，所述上游引物mngb-f的序列如seq id no.2所示，所述下游引物mngb-r的序列如seq id no.3所示。

6、上述引物对可以应用于制备阪崎克罗诺杆菌的鉴别试剂和试剂盒中，基于此，本发明的三个目的在于提供一种提供准确、快速、特异性强、广谱性强的阪崎克罗诺杆菌的rpa检测试剂盒，包括上述的引物对；所述试剂盒还包括缓冲液和无菌双蒸水；还可以包括基因抽提试剂和/或阳性基因组dna。

7、基于上述引物对，本发明的第四个目的在于提供一种非疾病的诊断或治疗目的的检测阪崎克罗诺杆菌的方法，包括以下步骤：采用上述引物对对待测样品dna进行rpa反应，反应完毕后检测是否存在阳性条带。

8、优选地，rpa反应的反应体系包括：反应缓冲液a buffer 29.4μl，反应缓冲液bbuff er 29.4μl，10μm所述上游引物2μl，10μm所述下游引物2μl，无菌双蒸水13.1μl，待测样品dna 1μl。优选的rpa反应条件为：37℃-42℃，15min-40min(更优选为37℃，30min)。可采用国产twistamp basic试剂盒予以实施。上述反应体系和反应条件是发明人经过不断的软件分析和实验而最终确定的最优情况，能够更好的实现效果。

9、在检测时，可通过琼脂糖凝胶电泳检测是否存在阳性条带；或者将产物进行纯化后，再采用琼脂糖凝胶电泳检测是否存在阳性条带。

10、上述方法可应用于检测婴幼儿奶粉、婴幼儿米粉、蔬菜和肉类等食品中的阪崎克罗诺杆菌，适用范围广。

11、本发明的有益效果为：本发明提供了一种新靶标，并基于靶基因片段提出了一种引物对和rpa检测方法，解决了现有阪崎克罗诺杆菌核酸检测的靶基因种类少且特异性不强的问题，具有广谱性强、特异性好、灵敏度高、准确度高、操作简单和成本低等优点，在食品检测领域有着良好的应用前景。

技术特征：

1.靶基因片段在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用，其特征在于，所述靶基因片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对根据权利要求1所述的靶基因片段设计得到，包括上游引物mngb-f和下游引物mngb-r，所述上游引物mngb-f的序列如seq id no.2所示，所述下游引物mngb-r的序列如seq id no.3所示。

3.一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液和无菌双蒸水。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基因抽提试剂和/或阳性基因组dna。

6.一种非疾病的诊断或治疗目的的检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求2所述的引物对对待测样品dna进行rpa反应，反应完毕后检测是否存在阳性条带。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，rpa反应的反应体系包括：反应缓冲液abuffer 29.4μl，反应缓冲液b buffer 29.4μl，10μm所述上游引物2μl，10μm所述下游引物2μl，无菌双蒸水13.1μl，待测样品dna 1μl。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，rpa反应条件为：37℃-42℃，15min-40min。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过琼脂糖凝胶电泳检测是否存在阳性条带。

10.权利要求6所述的方法在食品检测领域中的应用。

技术总结
本发明本发明属于分子生物学应用技术领域，具体涉及一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对、试剂盒和方法。该靶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该引物对根据该靶基因片段设计得到，包括上游引物mngB‑F和下游引物mngB‑R，其序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明提供的基于新靶标的靶基因片段的引物对和RPA检测方法，解决了现有阪崎克罗诺杆菌核酸检测的靶基因种类少且特异性不强的问题，具有广谱性强、特异性好、灵敏度高、准确度高、操作简单和成本低等优点，在食品检测领域有着良好的应用前景。

技术研发人员：翟平平,李睿,吴鑫,朱应飞,曾驰,刘中华
受保护的技术使用者：江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13