一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法

本发明属于生物，涉及一种研究油菜的基因功能的方法，具体涉及一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法。

背景技术：

1、病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，vigs)是植物体中天然存在的一种抵御外源核酸入侵的防御系统，正常情况下保护植物免受病毒的侵染。烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，trv)，是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体，能够介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。trv1包括编码rna依赖的rna聚合酶、运动蛋白和16kd蛋白的基因，是vigs体系的辅助病毒载体。trv2包括衣壳蛋白基因、多克隆位点等，用于插入目的基因。改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染，因此trv在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。

2、trv-vigs作为一种瞬时基因沉默技术，原理与rna干扰类似，其主要用来下调目标基因的表达。其技术原理为：将目的基因的片段装载到病毒载体中，然后用构建好的病毒载体侵染植株，从而引起受体植物同源基因沉默的现象。病毒载体刚进入植物体内时，由宿主的rna聚合酶复制其rna，形成双链病毒rna，然后由核酸内切酶识别、切割，形成小的干扰rna。最后被降解为单链，该单链rna会特异互补目标基因，形成局部双链rna结合，并激活植物体内的双链rna降解机制，从而使宿主植物中的目标基因被降解，即在转录后水平，特异的沉默目标rna。

3、与传统的转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比，vigs技术不需要植物的遗传转化或获取突变体，能简单、快速、瞬时、高效和特异地鉴定基因功能。随着vigs技术研究地不断发展，该技术已经广泛的应用在不同植物抗性、生长发育以及代谢调控等相关功能基因的研究鉴定上，成为研究植物基因功能的有效技术。

4、然而，目前研究油菜基因功能的方法存在耗时长、成本高、操作复杂等弊端，研究开发一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，进而来研究油菜的基因功能的相关研究还未见报道。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的是提供了一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，建立ptrv-vigs病毒沉默载体系统，通过农杆菌介导对油菜进行侵染，以期望能够简单快速、高通量的研究油菜基因功能。

2、本发明目的是通过以下方式实现：

3、本发明提供一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，主要包括以下步骤：

4、(1)通过pcr扩增获得油菜的基因保守区域bnbadh基因，验证后，进行切胶回收，得到目的基因片段，并对目的基因片段进行加a反应，通过连接酶将得到的目的基因片段与病毒基因表达载体ptrv2进行连接，得到ptrv2-bnbadh表达载体质粒；

5、(2)制备感受态农杆菌，加入步骤(1)得到的ptrv2-bnbadh表达载体质粒，在液氮中冷冻3-10min，再于35-39℃下静置3-10min后加入lb培养基，于25-30℃摇床培养1-4h，筛选，进行pcr菌落验证，验证正确的菌液留存待用；

6、(3)将步骤(2)的菌液培养到od600为0.6-0.8之间，将ptrv1与所得的菌液按照体积比为1:2-2:1的比例混合均匀，离心，去上清，在沉淀菌体中加入侵染液并于25-30℃摇床培养2-5h；

7、(4)将步骤(3)得到的菌液从油菜苗叶片背面于脉络之间注射，期间不可压破叶片，培养一段时间后，检测目的基因的表达情况。

8、基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中所述的pcr扩增条件为：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃15s，72℃10min。

9、基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中pcr扩增的引物的核苷酸序列如seq idno：1-2所示。

10、基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中切胶回收的具体过程为：于装有胶块的ep管中加入600μl溶胶buffer，待胶块融化将其加入吸附柱中静置3min后，于离心机中12000rpm下离心1min，再加入到吸附柱中，12000rpm下离心1min，倒离心液并加入600μl的washing buffer，静置3min后离心1min，将吸附柱换至1.5ml ep管，加50μl的ddh2o将dna洗脱下来，洗脱液于真空旋干仪上旋干20min，即得。

11、基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中加a反应的条件为：72℃60min，65℃10min。

12、基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中的连接酶为t4连接酶。

13、基于上述技术方案，进一步的，步骤(2)中农杆菌具体为农杆菌gv3101。

14、基于上述技术方案，进一步的，步骤(2)中感受态农杆菌的制备过程具体为：将农杆菌接种于lb培养基中，并于28℃摇床中过夜培养活化，从活化农杆菌中吸取500μl菌液于50ml含抗生素的lb培养基中，其中庆大霉素40μg/ml、利福平20μg/ml，在28℃摇床培养到od600约0.8，将菌液4000rpm离心10min，去上清，加60mm的cacl2溶液10ml并混匀，再离心10min，去上清，加1ml 60mm的cacl2溶液和100μl的二甲基亚砜，混匀制成感受态农杆菌。

15、基于上述技术方案，进一步的，步骤(3)中离心的条件为4℃下，3000-5000rpm离心3-10min。

16、基于上述技术方案，进一步的，步骤(3)中侵染液制备过程为：在100ml去离子水中依次加入0.205g的mgcl2、0.4275g的mes、100μl的200mmol乙酰丁香酮，调节ph至5.7-5.8之间，加20μl表面活性剂，搅拌均匀，即得。

17、基于上述技术方案，进一步的，步骤(4)中培养的条件为：在25℃下，光照15小时、黑暗9小时，培养7-14d。

18、本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

19、1.病毒诱导的基因沉默(vigs)技术在植物上直接产生rna干扰效果，大幅度节约时间和成本，vigs不受载体上的启动子等基因元件的限制，可同时沉默多个基因。

20、2.本方法避免了传统转基因体系研究的弊端，尤其适合转化体系不成熟的植物和受基因型限制的品种，因而可广泛用以油菜的基因功能研究。

21、3.本发明建立的油菜的ptrv-vigs病毒诱导基因沉默的方法下调油菜内源的目标基因的相对表达量，具有简单快速、高通量、易于操作的优势，为以后开展油菜基因功能研究提供了一种新途径和技术支持。

技术特征：

1.一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的pcr扩增条件为：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃15s，72℃10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中pcr扩增的引物的核苷酸序列如seq id no：1-2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中切胶回收的具体过程为：于装有胶块的ep管中加入600μl溶胶buffer，待胶块融化将其加入吸附柱中静置3min后，于离心机中12000rpm下离心1min，再加入到吸附柱中，12000rpm下离心1min，倒离心液并加入600μl的washing buffer，静置3min后离心1min，将吸附柱换至1.5ml ep管，加50μl的ddh2o将dna洗脱下来，洗脱液于真空旋干仪上旋干20min，即得。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中加a反应的条件为：72℃60min，65℃10min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中农杆菌具体为农杆菌gv3101。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中感受态农杆菌的制备过程具体为：将农杆菌接种于lb培养基中，并于28℃摇床中过夜培养活化，从活化农杆菌中吸取500μl菌液于50ml含抗生素的lb培养基中，其中庆大霉素40μg/ml、利福平20μg/ml，在28℃摇床培养到od600约0.8，将菌液4000rpm离心10min，去上清，加60mm的cacl2溶液10ml并混匀，再离心10min，去上清，加1ml 60mm的cacl2溶液和100μl的二甲基亚砜，混匀制成感受态农杆菌。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中离心的条件为4℃下，3000-5000rpm离心3-10min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中侵染液制备过程为：在100ml去离子水中依次加入0.205g的mgcl2、0.4275g的mes、100μl的200mmol乙酰丁香酮，调节ph至5.7-5.8之间，加20μl表面活性剂，搅拌均匀，即得。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中培养的条件为：在25℃下，光照15小时、黑暗9小时，培养7-14d。

技术总结
本发明公开了一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，属于生物技术领域。本发明首先通过PCR扩增获得油菜的基因保守区域BnBADH基因，再与病毒基因表达载体pTRV2连接，得到pTRV2‑BnBADH表达载体质粒转入感受态农杆菌，验证正确的菌液留存，将pTRV1与所得的菌液按照一定比例混匀，离心，所得沉淀菌体中加入侵染液，摇床培养，将得到的菌液从油菜苗叶片背面于脉络之间注射，培养一段时间后，检测目的基因的表达情况。本发明建立的油菜的pTRV‑VIGS病毒诱导基因沉默的方法下调油菜内源的目标基因的相对表达量，具有简单快速、高通量、易于操作的优势，为以后开展油菜基因功能研究提供了一种新途径和技术支持。

技术研发人员：刘志文,杨明煊,王晨晨,李芙蓉,于放,张悦,高潇潇,金朝霞
受保护的技术使用者：大连工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12