一种高光学稳定性的铁皮石斛多糖响应性荧光标记物及其制备方法

本发明属于医学生物技术检测领域，具体涉及一种高光学稳定性的铁皮石斛多糖响应性荧光标记物及其制备方法。

背景技术：

1、多糖是由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界的植物体中，有着在生物中储存能量和组成结构的作用，大量研究发现中药多糖参与介导细胞内各种生命活动的调节，其中铁皮石斛多糖具有降血糖、降血脂、增强免疫力、抗氧化、抗疲劳等药理作用且副作用较小，但其多糖的口服吸收及药物代谢亦处于初步探索阶段，严重制约了其代谢、药理机制和安全性评价等研究。

2、荧光标记技术是一种非放射性的标记技术，它是通过将能发射荧光的物质共价连接或物理吸附到目标分子的某个基团上，通过检测荧光物质来实现对荧光物质的定性和定量研究。目前现有的荧光染料也存在很多问题，例如荧光染料的斯托克斯位移一般不超过30nm，荧光染料易淬灭、信号不稳定，且不利于实现不同荧光信号之间的区分，限制了对糖分子的荧光检测。

3、目前已有的多糖荧光标记存在以下问题：

4、目前已有的多糖荧光标记有的是用于近红外成像下进行检测，合成过程较为繁琐、复杂需要使用催化剂并在保护气体的氛围中搅拌；

5、很多研究采用放射性同位素对多糖进行标记，以追踪其生物学活性，并研究其分子机制，但是成本较高，容易发生衰变不易保存，同时，放射性物质处理过程复杂容易对环境造成放射性污染，由于其会对人体造成有害效应，实用度不强。

6、对铁皮石斛多糖的研究中，主要通过高效液相色谱仪（hplc）、液质联用（lc-ms）与质谱检测器(msd)或蒸发光散射检测器(elsd)来检测，复杂且成本高，但这类检测仪器往往价格昂贵。

7、已有的多糖荧光技术多为香菇多糖、海胆多糖、壳聚糖等，石斛多糖较少。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术中荧光标记的多糖存在的荧光信号不稳定、且大多合成过程复杂、成本高产率低、对环境和身体健康不友好的缺陷。本发明的目的在于提供一种高光学稳定性的铁皮石斛多糖响应性荧光标记物及其制备方法。

2、具体技术方案如下：

3、一种高光学稳定性的铁皮石斛多糖响应性荧光标记物的制备方法，包括如下步骤：将铁皮石斛多糖冻干粉加入异硫氰酸荧光素（fitc）溶液中，于摇床上避光反应18~72h，再加入无水乙醇，进行水提醇沉，4℃静置2h后1000-5000 r/min离心10分钟，弃上清，留沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，重复1-8次，离心，离心后沉淀采用冷冻干燥机进行冻干，最终得到响应性荧光标记的铁皮石斛多糖dop-fitc。

4、进一步地，冻干温度为-70~-20℃，真空度为10-50pa。

5、进一步地，fitc溶液采用如下方法配制：

6、1）配制基本液：将pbs粉包溶于容量瓶中得到pbs缓冲液，ph在室温25℃时为2.0-14.0，优选地，ph在室温25℃时为7.2-9.0；

7、2）配制fitc溶液：取基本液5-15ml，加0.20-1.50mgfitc，配成fitc溶液，现用现配。

8、一种采用上述的制备方法制备得到的高光学稳定性的铁皮石斛多糖响应性荧光标记物。

9、本发明还提供了一种研究铁皮石斛多糖的口服吸收及其机制的方法，所述方法使用上述响应性荧光标记铁皮石斛多糖的方法制备的响应性荧光标记的铁皮石斛多糖进行。所述机制包括铁皮石斛多糖的代谢排泄及药理作用等方面。

10、在一个实施方式中，根据本发明研究铁皮石斛多糖的口服吸收及其机制的方法包括，(1)使用根据本发明的响应性荧光标记铁皮石斛多糖的方法制备响应性荧光标记的铁皮石斛多糖；(2)使用步骤(1)得到的响应性荧光标记的铁皮石斛多糖研究该多糖的口服吸收及其机制。

11、本发明与现有技术相比，具有如下优点：本发明用响应性荧光标记过后的铁皮石斛多糖在488 nm处有紫外特征吸收峰和明显的荧光强度。应用响应性荧光标记过后的铁皮石斛多糖示踪铁皮石斛多糖的方法快速、便捷，所要用到的检测设备常见且检测成本低，易于推广。能用于相应的药物代谢、药理作用等多方面的基础研究，是一种操作简单安全、标记效率高、产率高、结合紧密、溶解度好、荧光稳定时间长且不影响多糖内部结构同时能有效区分不同的荧光信号也保证铁皮石斛多糖增强免疫力、降血糖等生物学活性的荧光标记方法。

技术特征：

1.一种高光学稳定性的铁皮石斛多糖响应性荧光标记物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将铁皮石斛多糖冻干粉加入fitc溶液中，于摇床上避光反应18~72 h，再加入无水乙醇，进行水提醇沉，静置后1000-5000 r/min离心10分钟，弃上清，留沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，重复1-8次，离心，离心后沉淀采用冷冻干燥机进行冻干，最终得到响应性荧光标记的铁皮石斛多糖dop-fitc。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于冻干温度为-70~-20℃，真空度为10-50pa。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于fitc溶液采用如下方法配制：

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于ph在室温25℃时为7.2-9.0。

5.一种采用如权利要求3所述的制备方法制备得到的高光学稳定性的铁皮石斛多糖响应性荧光标记物。

技术总结
本发明公开了一种高光学稳定性的铁皮石斛多糖响应性荧光标记物及其制备方法，该荧光标记的铁皮石斛多糖，由多糖直接共价偶联异硫氰酸荧光素染料形成，在488nm左右具有明显的荧光吸收峰，在肠道等组织环境的稳定性和荧光响应值高，适用于生物体内外铁皮石斛多糖的检测，上述响应性荧光标记的铁皮石斛多糖，还明显优于现有常用碳酸盐缓冲体系荧光标记制备获得的多糖。本发明的铁皮石斛多糖响应性荧光标记物具有光学稳定性强、操作简单安全、标记效率高、产率高、结合紧密、溶解度好、荧光响应值高等优点，不需特殊基团改造，不改变其生物活性，即可用于其口服吸收、代谢排泄及药理功效等多方面研究。

技术研发人员：陈素红,熊泽平,吕圭源,李波,贺行理商,万莹,谢至祎
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13