一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及了一种提取血浆游离dna的试剂盒、制备方法及提取方法。

背景技术：

1、游离dna(cell-free dna，cfdna)是一种血液或体液中游离于细胞之外的dna。1947年，mandel和metais首次报道了外周血中存在cfdna。生理情况下，血液中的cfdna主要来源于白细胞的坏死和凋亡，在某些疾病和特殊状态下，其他细胞也会释放游离dna进入血浆，包括来源于肿瘤细胞的循环肿瘤dna(circulating tumor dna，ctdna)，来源于胎儿的cfdna等。1994年，vasioukhin等和sorenson等在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和胰腺癌患者外周血ctdna中发现了ras基因的突变，表明可以利用ctdna发现肿瘤的特异性基因突变。随着新的研究结果的不断出现，cfdna用于疾病早期诊断、预后评估、疗效监测等方面的潜在价值越来越受到关注。检测血浆或血清中cfdna可视为一种"液体活检"，有利于开展各种相关诊断，并能避免有创的组织活检。以血液为检测标本，使重复采集检测样本成为了可能，从而有利于对疾病的发展及肿瘤的治疗过程进行跟踪监测。

2、目前cfdna检测对方法学要求极高，虽然目前cfdna的检测方法都具有很高的敏感度和特异度，但是仍存在一些和传统病理学或细胞遗传学检测结果不一致的情况。由于血浆中存在的靶cfdna微乎其微，标本的采集、抗凝剂使用和保存的不当都会影响检测的质量，造成假阳性或假阴性的结果所以，优化提取和检测的方法，进一步提高检测cfdna方法的灵敏度和特异性，缩短检测的时间，降低检测的成本，同时实现检测方法之间的标准化，都是亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提取血浆游离dna的试剂盒、制备方法及提取方法技术，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种粪便样本dna核酸提取试剂盒，试剂盒主要包括以下组分：蛋白酶k、裂解缓冲液、结合缓冲液、漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2、洗脱缓冲液。

4、蛋白酶k：

5、蛋白酶k属于丝氨酸蛋白酶sb超家族中的s8家族，由一条肽链组成，具有很高的切割活性，底物识别位点能和底物组成一个3股的反平行β片层，可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂。此酶经纯化去除了rna酶和dna酶活性。蛋白酶k在ph 4-12.5较广的ph范围内均有活性，作用温度范围为37-65℃。

6、蛋白酶k血浆样本中与蛋白酶k的质量/体积比为5：1-10：1，蛋白酶k的浓度范围为10mg/ml-30mg/ml。

7、优选的，待处理样本与蛋白酶k的体积比为10：1，所述蛋白酶k的浓度范围为20mg/ml。

8、裂解缓冲液：

9、裂解缓冲液包括：1-4.5m异硫氰酸胍、1-6mm edta、20-150mm tris-hcl、0.05％-20％np40，ph为4-6。

10、优选的，裂解缓冲液中的成分含量为：4m异硫氰酸胍，6mm edta，100mm tris-hcl，10％ np40，裂解液的ph为5.5。

11、本发明提供的裂解缓冲液在裂解血浆样本时，使样品中的核酸游离在裂解体系中，促进核酸与蛋白分离，从而释放核酸。

12、具体原理介绍如下：

13、异硫氰酸胍：白色结晶性粉末，异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，无rna酶和dna酶活性。在核酸提取中，异硫氰酸胍能够迅速破碎细胞或病毒释放核酸，抑制细胞释放出的核酸酶，保证核酸一级结构的完整性。

14、edta：即乙二胺四乙酸，其能够与mg2+、ca2+、mn2+、fe2+等金属离子结合，可防止金属离子激活蛋白酶，从而减少金属离子对核酸质量的影响。

15、tris-hcl：有助于在细胞裂解和提取过程中保持ph稳定，维持核酸磷酸基团与硅胶膜的带电状态，利氢键的保持，防止核酸被破坏。

16、np40：是一种温和的非离子型去垢剂，1％浓度基本可以破坏掉细胞膜，而对核膜的破坏作用较弱，结合特定的缓冲液可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解从而释放核酸。

17、结合缓冲液

18、结合缓冲液，包括：1-4m异硫氰酸胍、1-3m盐酸胍、20-150mm tris-hcl、1-6mmedta、0.05％-30％ tween20、10％-30％ peg 8000、10％-35％异丙醇，ph为4-8。

19、优选的，结合缓冲液中的成分含量为：4m异硫氰酸胍，2m盐酸胍，100m tris-hcl，4mmedta，0.10％tween20，10％peg 8000，30％异丙醇，其ph为7.5。

20、具体原理介绍如下：

21、盐酸胍：是核酸酶的强抑制剂，但并不是强变性剂，它在核酸提取中的主要作用是使蛋白质变性并抑制酶活性。盐酸胍能够快速破坏细胞膜，使得蛋白质变性沉淀，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕。

22、tween20(吐温)：为非离子型表面活性剂，用来破坏细胞膜(裂解细胞)以释放细胞内的可溶性物质。它们可以破坏蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质、脂质-脂质之间的连接，使蛋白质发生结构上的变性，去除与核酸相互作用的蛋白质。

23、peg 8000(聚氧乙烯8000)：在空气中易发生氧化降解，需尽量避免将其暴露在空气和或高温环境，活化后可以结合多肽或蛋白质，用于沉淀蛋白，原理是通过空间位置排斥，使蛋白质被迫集聚在—起而引起沉淀的发生。

24、异丙醇：能够夺取rna/dna周围的水分，因此rna/dna能够聚集而发生沉淀。

25、漂洗缓冲液1

26、漂洗缓冲液1，包括：1-3m盐酸胍、20-150mm tris-hcl、0.05％-30％ tween20、10％-35％无水乙醇，ph为5-8。

27、优选的，漂洗缓冲液1的组成成分为：2m盐酸胍，50mm tris-hcl，10％ tween20，35％乙醇，ph为8.0。

28、漂洗缓冲液2

29、漂洗缓冲液2，包括：20-150mmtris-hcl、1-6mmedta、30％-60％无水乙醇，ph为5-8。

30、优选的，漂洗缓冲液2的组成成分为：100mm tris-hcl，4mm edta，60％乙醇，ph8.0。用于洗去残留的盐离子和胍盐，以免对核酸提取后的后续分子生物学实验产生不利影响。

31、洗脱缓冲液

32、洗脱缓冲液为无酶水、灭菌水中的一种。

33、第二方面，本发明提供一种提取血浆游离dna的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

34、a.获取蛋白酶k；

35、b.裂解缓冲液制备：在去离子水中加入所述异硫氰酸胍、tris-hcl、edta和np40，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的ph至4-6；

36、c.结合缓冲液制备：在去离子水中加入所述异硫氰酸胍、盐酸胍、tris-hcl、edta、peg 8000、异丙醇和tween-20，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的ph至4-8。

37、d.漂洗缓冲液1制备：在去离子水中加入所述盐酸胍，tris-hcl、tween20，无水乙醇，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的ph至5-8。

38、e.漂洗缓冲液2制备：在去离子水中加入所述tris-hcl、edta和无水乙醇，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的ph至5-8。

39、f.洗脱缓冲液为无酶水、灭菌水中的一种。

40、第三方面。本发明提供一种提取血浆游离dna的试剂盒的提取方法，包括以下步骤：

41、a.样本裂解

42、血浆或样本：向离心管(自备)中加入1ml血清/血浆样本，若样本不足1ml，加入pbs溶液补至1ml体积，向以上溶液中加入100ul蛋白酶k，混匀，加入800ul裂解缓冲液，剧烈震荡至少30秒；

43、b.吸附结合

44、60℃孵育30分钟，其间颠倒混匀，加入1800ul结合缓冲液，颠倒混匀10次或剧烈震荡15-30秒，冰浴5分钟，正确连接负压装置，将连接管插到负压装置的插口上，将吸附柱插入到连接管上，将延伸管插入开盖的吸附柱中，将冰浴后的混合溶液全部加入延伸管中，开启并调节负压至-900～-800mbar，缓慢吸走管中溶液。待溶液完全吸走，关闭负压开关，当压力恢复至0mbar时，小心移去延伸管；

45、c.漂洗

46、向吸附柱中加入500ul漂洗缓冲液1,开启并调节负压至-900～-800mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关；向吸附柱中加入750ul漂洗缓冲液2，开启并调节负压至-900～-800mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关；向吸附柱中加入750ul无水乙醇，开启并调节负压至-800～-900mbar，待溶液完全吸走，关闭负压开关；当压力恢复至0mbar时，将吸附柱取下，置于新的收集管中，12,000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液；

47、d.洗脱

48、将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-150ul洗脱缓冲液，室温放置3分钟，12,000rpm离心1分钟，收集dna溶液，-20℃保存dna。

49、与现有技术比，本发明达到的有益效果是：

50、(1)操作简单快速，可进行微量提取：试剂盒可与负压装置匹配使用，其操作简便，省去传统的离心步骤，直接利用负压装置抽提，能够快速高效提取血浆中的游离核酸，使得利用少量血浆样本即可获得较高纯度和得率的核酸，满足后续核酸检测用量。

51、(2)提取核酸纯度高，不含检测抑制剂：提取的核酸不含核酸酶及检测抑制剂，dna保存时间长，后续运用于pcr、荧光定量pcr和二代测序等分子生物学实验，利于血浆样本核酸的保存和检测。

52、(3)成本低：试剂盒所有组分均为自主研发，并实现了量产，成本低，可满足分子生物学多领域研究和应用，具有广泛的应用前景和市场推广价值。