双基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种基因重组的减毒非洲猪瘟病毒株δ7r/i267l的构建及其作为疫苗的应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2019年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁，其中与2018年8月相比，2019年9月中国生猪产量下降了40％，猪肉价格自2019年8月以来上涨了一倍，已造成全国40％以上减产率，损失严重。当前没有商品化的有效疫苗，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，无法满足我国规模化养猪的需要。因此，疫苗作为预防和控制病毒传染病最有效、最经济的手段，对于我国规模养猪模式下的非洲猪瘟的防治至关重要。但非洲猪瘟病毒(asfv)结构复杂、基因组庞大，大部分功能未知，感染与致病机制不清，疫苗创制的理论认知有限，其流行已逾百年，目前只有越南政府批准了一种基因缺失弱毒疫苗的商业化应用，但其安全性和有消息还需要进一步的验证。

2、目前对于非洲猪瘟疫苗的制备主要通过三种方式：一是直接对原始非洲猪瘟病毒进行灭活得到灭活疫苗；二是筛选出有效诱导免疫应答的病毒蛋白，进而制备亚单位疫苗和活载体疫苗；三是采用基因缺失手段，敲除毒力基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用、最直接的方法，但是，由于非洲猪瘟病毒编码免疫抑制、免疫耐受和抗体依赖增强作用(ade)等蛋白，灭活疫苗免疫猪内无法提供有效的免疫保护作用；第二种方面是非洲猪瘟病毒结构复杂，目前诱导免疫应答的蛋白还未清楚，获得的抗原还不足以诱导坚强的免疫保护作用。而目前最有望突破的疫苗就是基因敲除疫苗，通过对免疫抑制、耐受、ade等毒力相关基因的敲除，获得既具有免疫原性，又能降低致病性，免疫猪获得免疫保护作用的疫苗候选毒株。

3、对于猪瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考虑到对猪的免疫应答和保护性，又要兼顾致病性和安全性能。但是现有技术中猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗还考量如下因素：(1)敲除的毒力基因是否减少带毒、排毒，是否带来组织损伤和影响生产性能等是生物安全的一个重要指标，也是基因缺失疫苗安全性不断提升的一个重要指标；(2)不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分存在毒力和致病性残留问题；以及多基因缺失造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险；(3)非洲猪瘟的全基因组测序工作虽然已经完成，但是组成非洲猪瘟病毒的调控基因和结构基因高达160多个，虽然工程巨大，但对调控基因和结构基因的功能对其致病机理和疫苗研制至关重要；(4)联合敲除毒力基因的选择至关重要，不同选择配合会产生不同甚至相反的免疫保护效果。

4、因此，虽然毒力基因的敲除是构建非洲猪瘟减毒株的一种策略，但是在不同病毒中敲除相同的基因也会导致效果的显著差异，而且在联合敲除过程中毒力基因的选择也至关重要，并不是任意毒力基因的联合敲除均会实现减毒保护的功效。例如，①在不同种类的非洲猪瘟病毒中敲除nl基因(即dp71l基因)后获得肩部保护效果不同，其中，在e70nl基因的敲除所得非洲猪瘟病毒株的毒力完全消失；在pr4中敲除nl基因，所得毒株pr4-δn-sl在102tcid50剂量下，虽然延迟了猪死亡及发病时间，但是有接近86％的致死率；在mal中敲除nl基因所得毒株mal-δnl仍保持极高的毒力，在102tcid50剂量下的致死率为100％。dp148r基因缺失的benin 97/1株也能够使得病毒充分致弱，免疫猪后存活率也是100％，但dp148r基因缺失中国流行株免疫株后的存活率仅仅为0％；②虽然公开了将mgf505/530家族基因与mgf360家族基因联合敲除能够产生一定的减毒保护作用，但是mgf360与mgf505/530和b119l联合敲除时，不具有减毒保护作用；而在e70△nl(敲除nl基因的e70毒株)中联合删除mgf360/505的几个成员反而会导致减毒菌株(e70△nl)的毒性增强；③目前，公开较多的是cd2v与mgf360/505家族基因的联合敲除，例如cd2v与mgf360-12l、mg f360-13l、mgf360-14l的联合敲除、mgf360/505基因全部缺失以及cd2v与mgf360/505全部基因的联合缺失；但是获得的减毒株虽然会提供一定的免疫保护效果，但是在对猪免疫后，猪血清里仍然能够检测到病毒的存在，安全性仍然存在问题；而且发明人研究发现mgf 505-7r、mgf110-9l、dp71l和dp148r基因的联合缺失，构建的重组毒，免疫保护效果较差，保护率仅只有50％。

5、针对上述，本发明通过联合缺失mgf505-7r和i267l基因，获得了一株安全性较好的减毒非洲猪瘟病毒株；肌肉注射高剂量所述减毒非洲猪瘟病毒株(104had50/头)猪仍不发病，说明该毒株肌肉注射不能够致猪发病死亡；攻毒实验表明，所述减毒非洲猪瘟病毒株能对asfv cn/gs/2018分离的强株攻毒具有较高的免疫保护效率，因此，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明提供一种构建减毒非洲猪瘟病毒株的策略，所述策略为：联合缺失亲本毒株中mgf505-7r基因的全部核苷酸序列和i267l基因的部分核苷酸序列，从而使这两个基因编码的蛋白均无法正常表达，导致其编码蛋白功能的丧失。

2、根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使mgf505-7r和i267l基因编码的蛋白功能同时丧失，成功构建减毒非洲猪瘟病毒株，例如：移码突变、点突变、缺失或插入核苷酸序列等。

3、具体技术方案包括：

4、第一方面，本发明提供了通过在ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs 2018中联合缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，所述基因片段包括mgf505-7r基因的全部或部分核苷酸序列和i267l基因的全部或部分核苷酸序列；所述ii型非洲猪瘟病毒株asfvcn/gs 2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：v202096。可以通过缺失mgf505-7r和i267l基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失，也可以仅通过缺失mgf505-7r和i267l基因的部分核苷酸序列(包括mgf505-7r和i267l基因的启动子序列)使mgf505-7r和i267l基因编码的蛋白无法表达，导致其编码蛋白功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使mgf505-7r和i267l基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。

5、优选地，所述缺失的基因片段为ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs 2018全长序列的第40752-42335位和第169821-170380位。

6、第二方面，本发明提供了通过在ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs 2018中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，所述基因片段包括mgf505-7r基因的全部或部分核苷酸序列和i267l基因的全部或部分核苷酸序列；所述ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：v202096。可以通过缺失mgf505-7r和i267l基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失，也可以仅通过缺失mgf505-7r和i267l基因的部分核苷酸序列(包括mgf505-7r和i267l基因的启动子序列)使mgf505-7r和i267l基因编码的蛋白无法表达，导致其编码蛋白功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使mgf505-7r和i267l基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。

7、优选地，所述缺失的基因片段为ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs 2018全长序列的第40752-42335位和第169821-170380位。

8、第三方面，本发明提供了一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为基因片段缺失的ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs 2018；所述基因片段包括mgf505-7r基因的全部或部分核苷酸序列和i267l基因的全部或部分核苷酸序列；所述ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs 2018保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v202096。可以通过缺失mgf505-7r和i267l基因的全部核苷酸序列导致其编码蛋白功能的丧失，也可以仅通过缺失mgf505-7r和i267l基因的部分核苷酸序列(包括mgf505-7r和i267l基因的启动子序列)使mgf505-7r和i267l基因编码的蛋白无法表达，导致其编码蛋白功能丧失。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使mgf505-7r和i267l基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。

9、优选地，所述缺失的基因片段为ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs 2018全长序列的第40752-42335位和第169821-170380位。

10、第四方面，本发明提供了一种非洲猪瘟疫苗，所述非洲猪瘟疫苗包括上述第三方面所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株。

11、第五方面，本发明提供了一种制备上述第三方面所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，所述的方法是通过基因工程手段将原始ii型非洲猪瘟病毒株asfv cn/gs2018中mgf505-7r基因的全部或部分核苷酸序列和i267l基因的全部或部分核苷酸序列缺失。

12、优选地，所述方法为同源重组技术。

13、优选地，所述方法包括以下步骤：

14、(1)设计mgf505-7r基因上游和下游序列各1.0kb作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂基因与egfp基因筛选表达盒基因片段p72-egfp-sv40 polya同时克隆至puc57载体，获得重组质粒p7r-egfp；

15、(2)设计i267l基因上下游序列各1.0kb作为左右同源重组臂，将所述的左右同源重组臂与mcherry基因筛选表达盒基因片段p72-mcherry-bgh polya同时克隆至puc57载体，获得重组质粒pi267l-mcherry；

16、(3)将重组质粒p7r-egfp和pi267l-mcherry依次转染至感染asfv原始毒株的bmdm细胞，构建得到mgf505-7r和i267l基因联合缺失的减毒非洲猪瘟病毒δ7r/i267l。

17、本发明的有益效果是：本发明通过联合丧失mgf505-7r和i267l基因编码蛋白的功能，获得了一种减毒非洲猪瘟病毒株；所述的减毒非洲猪瘟病毒株毒力显著致弱，高剂量不产生发病和致死现象；用此减毒非洲猪瘟毒株免疫后，猪对亲本毒株asfv cn/gs/2018分离株具有较好的保护作用，适于作为预防非洲猪瘟的疫苗候选株。