TCOF1基因突变体及其应用的制作方法

本发明属于生物，尤其涉及tcof1基因突变体及其应用。

背景技术：

1、treacher-collins综合征(treacher-collins syndrome：tcs，omim：154500)是一种极为罕见的先天性颅面部发育异常，常见的遗传模式为常染色体显性遗传。其主要临床表现为：颅面骨发育不全，包括颧骨和下颌发育不良、小耳畸形、外耳道闭锁、睑裂外下垂、唇裂或巨口等，形成特征性的“鱼面样”面容，发病率约为1/50000，约40%的病例有家族史，60%的病例为散发病例。

2、tcof1基因（omim 606847）位于染色体5q32-33.1区，由28个外显子构成，编码由1411个氨基酸组成的treacle蛋白。treacle蛋白位于细胞核的致密纤维成分上，研究者推测适当的treacle蛋白对于调节神经上皮和神经嵴细胞的成熟核糖体的产生有重要作用。tcofl基因突变导致treacle蛋白单倍剂量不足，在胚胎第15～18周影响第一、二腮弓的形成，无法满足颅面神经嵴细胞增殖，从而导致颅面畸形。根据人类基因突变数据库(humangenemutation database，hgmd)已报道的tcofl基因突变已有250余种，包括错义突变、无义突变、缺失突变和插入突变等多种突变类型，同时还包括剪切位点突变和dna片段重排，其中缺失突变、剪切位点突变可致阅读框的移码突变，使蛋白质肽链合成提前终结，即主要为移码突变导致treacle截短蛋白。

3、目前对于tcof1基因的研究亟需深入的探索tcof1基因中会导致tcs综合征的突变，并且据此可研发相应的诊断和治疗的方案。比如，还需进一步研究tcof1基因对tcs综合征的影响，进而研究从基因层面实现对tcs综合征的预防和治疗。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供tcof1基因突变体及其应用，主要为了填补部分对tcof1基因研究的空白，同时对tcs综合征致病原因做进一步研究，探究其成因和可治疗方案。

2、为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面涉及核酸，包括含下列目标片段，

4、所述目标片段与序列为seq id no：1的野生型tcof1基因相比，具有c.3337c>t突变。

5、在前述基础上，所述核酸的类型包括dna、rna或cdna，核酸的类型不做具体的限定，只要其与野生型tcof1基因相比具有特定的突变，则应当认定其为本条范围内的核酸。

6、本发明第二方面涉及多肽，与序列为seq id no：2的野生型tcof1基因编码的蛋白相比，所述多肽具有p.q1113*突变。突变型tcof1基因编码的产物与野生型蛋白（或多肽，两者等同。后续解释相同）(seq id no：2)相比，具有p.q1113*突变，即第1113位氨基酸由谷氨酰胺变为终止密码子，使蛋白多肽链合成提前终止。

7、本发明第三方面涉及生物模型在筛选药物中的应用，其特征在于，所述生物模型至少携带下列之一：

8、a.核酸，与序列为seq id no：1的野生型tcof1基因相比，具有c.3337c>t突变，

9、b.多肽，与序列为seq id no：2的野生型tcof1基因编码的蛋白相比，所述多肽具有p.q1113*突变。

10、所述生物模型一种形式为细胞模型。该细胞模型的一种应用方式为进行规模化的药物筛选，可以通过药物对细胞模型进行作用，验证该药物是否具有抑制相应突变的作用，并可据此进一步验证该药物是否可以通过抑制突变实现治疗相应的疾病，比如通过该细胞模型即可实现模拟tcs综合征的疾病环境、然后进一步通过该模型实现体外验证部分药物的作用。在本条中，主要考虑的筛选因素是针对相应的突变，暂不具体限定药物的具体治疗对象，该种应用方式主要在药物研发过程中进行使用。其中，所述药物为治疗tcs综合征的药物；tcs综合征主要是由前述突变导致。更具体的，所述药物为防治tcs-1综合征的药物。由此，通过本生物模型实现了对一些作用效果未知的物质进行筛查，方便进一步研究该物质是否具有用于治疗tcs综合征的预期。

11、本发明第四方面涉及检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中应用，所述试剂盒或设备用于筛查或诊断tcs综合征；其中，

12、所述核酸与野生型tcof1基因相比，具有c.3337c>t突变；所述多肽与野生型tcof1基因编码的蛋白相比，具有p.q1113*突变。筛查tcs综合征主要是患病风险排查，便于提前干预；诊断则是对于已经患病的人员进行辅助诊断，当然是否已经患病是以患者机体实际变化、相应的标准规范为依据，不以人的主观认知干预。

13、所述试剂包括特异性针对所述核酸和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。具体为试剂包括特异性检测核酸的产品，还包括特异性检测多肽的产品，该产品至少可为抗体、探针、引物以及质谱检测试剂中任一，同时还可为其他具有相似功能的试剂。另外，试剂盒的形式可为一些与现有产品类似的试剂盒，设备则可为一些序列检测设备。引物和探针均可选择其中任一，也可根据需要进行组合使用。

14、更为具体的，所述引物至少包括序列如下的引物对（60度，386bp）：

15、正向引物：ctgcatgtgtgccccatcta，

16、反向引物：ccacacaacaccctcttcct；

17、所述探针序列为：gaggtgctctggggacttgtt。

18、优选的，所述tcs综合征为tcs-1综合征。制备所得的相应检测产品不仅可以用于筛查和诊断tcs综合征，同时可以更为精准地筛查易感tcs综合征人群，还可对tcs综合征患者进行诊断，相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，同时前述探针、引物在进行相应检测过程中具有更好的效果。

19、本发明第五方面涉及筛选tcs综合征生物样品的试剂盒，包含有能检测tcof1基因突变体的试剂；

20、与序列为seq id no：1的野生型tcof1基因相比，所述tcof1基因突变体具有c.3337c>t突变，或与序列为seq id no：2的野生型tcof1基因编码的蛋白相比，所述tcof1基因突变体具有p.q1113*突变。在该种情况下，只要相应的产品应用到了能够检测前述两种tcof1基因突变体中任一的试剂时，均应当视为应用了本发明的技术。

21、所述试剂为核酸探针或引物。所述引物包括序列如下的引物对：

22、正向引物：ctgcatgtgtgccccatcta，

23、反向引物：ccacacaacaccctcttcct；

24、所述探针序列为：gaggtgctctggggacttgtt。

25、优选的，tcs综合征生物样品为tcs-1综合征样品；该种样品的主要来源为疑似患者，比如患者的外周血、皮肤、皮下组织等。相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，可以更快速的“无创”检查。该种试剂盒可用于对风险病例进行检测，也可在某些场景中进行大规模的风险排查，尽早的筛查出风险人群。文中提到的野生型tcof1的相关序列也可直接查询领域内常用的网站，其为公知内容。

26、本发明第六方面涉及特异性改变核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗tcs综合征；其中，所述核酸与野生型tcof1基因相比，具有c.3337c>t突变；所述试剂至少为基于shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、crispr-cas9、crispr-cpf1、锌指核酸酶中之一的试剂。

27、所述试剂至少为基于shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、crispr-cas9、crispr-cpf1、锌指核酸酶中之一的试剂，当然还可基于其他具有相似功能的物质。如crisprs技术是一种由rna指导cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，rispr-cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于crispr-cas9的方法，可以设计出sgrna并合成该序列的grna，然后将grna与dcas9在细胞中共表达，通过grna介导dcas9蛋白与目标dna区域结合，进而实现特定位点的修复或改变，恢复蛋白功能，相应的编辑技术均已是常规现有技术，在此不做赘述，当然所有项目的实施都必须依法施行。在本条中，主要修复的特定位点就是tcof1基因的c.3337c>t的突变位点。优选的，所述tcs综合征为tcs-1综合征，通过针对性进行用药，使得相应的致病基因修复，实现疾病的预防和治疗。试剂盒也应当做宽泛的解释，还包括一些检测试纸、设备等。

28、本发明第七方面涉及构建体，包含有核酸，该核酸包括含下列目标片段，所述目标片段与序列为seq id no：1的野生型tcof1基因相比，具有c.3337c>t突变。构建体同样可以在制药过程中作为药物作用效果的检验模型。

29、本发明第八方面涉及重组细胞，所述重组蛋白是通过前述的构建体转化受体细胞获得。根据本发明实施例的重组细胞可作为细胞模型，用于科学研究或商业化药物研究，如药物筛选或tcof1基因的致病机理研究。

30、需要说明的是，上述给出的突变位点以及序列等，均是以burrows wheeler测序平台内容作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准找到，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。

31、本发明的有益效果是：

32、为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究了该突变基因的应用。确定了本发明涉及的突变与tcs综合征的联系，并据此为tcs综合征的治疗提供新的治疗方案，尤其是为tcs综合征提供了诊断治疗的手段。