一种细胞保存卡、使用方法及在基因组扩增上的应用与流程

本发明涉及单细胞全基因组扩增，具体涉及一种细胞保存卡、使用方法及在基因组扩增上的应用。

背景技术：

1、基因组dna扩增是现有测序技术的必要第一步。聚合酶链反应(pcr)已被调整为具有生物学意义的基因组可复制区域。应用于——法医学、胚胎疾病诊断、生物恐怖主义基因组检测、临床样本的“永生化”、微生物多样性和基因分型。

2、在过去的10年中，单细胞基因组的分析很明显的提供了在组织批量测序中丢失的关键信息，因为平均效应和计算方法的局限性，用于对来自许多不同克隆的序列信息进行去卷积序列信息。例如，癌症基因组改变的复杂性直到最近才通过平行评估单个肿瘤细胞来掌握。特别是对于肿瘤学，单细胞测序为癌症随时间推移和对治疗的反应的演变提供了新的见解，这将为治疗方案和药物开发带来新的策略。

3、目前，临床上针对细胞保存的方法大多为液基细胞保存液的保存方法，液基细胞保存液在保存宫颈脱落细胞及其制片技术上十分成熟，这在宫颈癌筛查上发挥了十分重要的作用。相似的液基细胞保存液也被应用于细针穿刺细胞的保存，主要有两类：一类是以甲醇、乙醇为基础的保存液，这类保存液中的成分会对pcr扩增产生抑制作用；另一类是在醇类固定液中加入红细胞裂解试剂冰醋酸，这类保存液会对细胞造成明显的损伤，使其形态结构改变。这样会使细胞在保存液中放置后不能保持完整细胞的形态，使后续基因组扩增变得很困难，有时甚至因为保存液的抑制从而无法获取基因组dna。

技术实现思路

1、本发明目的是针对现有细胞保存方法会对pcr扩增产生抑制作用以及会对细胞造成明显的损伤，使其形态结构改变的问题，设计一种细胞保存卡、使用方法及在基因组扩增上的应用。本发明细胞保存卡能够在常温运输情况下下保存细胞1-7天，保证其完整性并能够以此为模板，实现细胞全基因组扩增。具体采用如下技术方案：

2、一种细胞保存卡，包括保存卡、ph指示剂、抗菌剂、核酸保护剂；ph指示剂包括染液、抑菌剂、核酸保护剂、细胞保护剂；染液、抗菌剂、核酸保护剂和细胞保护剂之间的质量比为95：2：2：1。

3、优选的，保存卡为康为世纪特质用纸，专用于此类保存卡制作，如血液保存卡或细胞保存卡。

4、优选的，染液选自偶氮染料、蒽醌染料、芳甲烷染料、靛族染料、硫化染料、酞菁染料、硝基和亚硝基染料、甲川和多甲川类染料、二苯乙烯类染料以及杂环类染料中任一种或多种。

5、优选的，抑菌剂选自甲醛及其衍生物、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、重氮烷基脲、咪唑烷基脲中任一种或多种。

6、优选的，核酸保护剂选自肝素、金精三羧酸、甲酰胺、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸盐、dtt、ata任一种或多种。

7、优选的，细胞保护剂选自甘氨酸、天冬氨酸、半胱酰胺、谷氨酰胺、甘油醛-3-磷酸任一种或多种。

8、一种细胞保存卡使用方法，包括以下步骤：

9、步骤1：使用保存卡，通过ph指示剂、抗菌剂、核酸保护剂将保存卡染色、防腐、晾干后形成细胞保存卡；

10、步骤2：通过流式细胞仪分选，缓冲液稀释，显微操作和激光显微切割方式获得单细胞，将单细胞点于细胞保存卡上，自然室温晾干后使用打孔器将带有细胞的卡片打孔，并放置于无酶无菌200μl pcr管中；

11、步骤3：单细胞通过30min裂解、90min预扩增、40min扩增的全流程后即可获得最终产物。

12、一种细胞保存卡在基因组扩增上的应用，细胞保存卡在单细胞全基因组扩增上应用。

13、优选的，细胞保存卡在单细胞全基因组扩增上的应用包括扩增产物下游应用于荧光定量pcr、高通量测序，应用于snp检测、cnv检测相关下游应用。

14、与最接近的现有技术比，本发明提供的技术方案具有如下有益效果：

15、1、本发明细胞保存卡能够有效抑制杂菌的生长，使用细胞保存卡点涂后可以直观分辨细胞所在位置，干燥纸张可以防止核酸酶降解，解决了胚胎细胞运输费用高昂、运输过程繁琐、细胞破裂或杂菌生长造成后续扩增失败、细胞冻融后完整性损失的问题；

16、2、本发明使用细胞保存卡，能够在常温运输环境下保存细胞1-7天，并在细胞运输中保证其完整性，能够有效抑制杂菌生长，直观分辨细胞所在位置，并能够使用单细胞扩增试剂盒扩增全基因组；

17、3、本发明细胞保存卡可应用于单细胞全基因组扩增，包括扩增产物下游应用于荧光定量pcr、高通量测序，还可应用于snp检测、cnv检测等相关下游应用。

技术特征：

1.一种细胞保存卡，包括保存卡，其特征在于：还包括ph指示剂、抗菌剂、核酸保护剂；所述ph指示剂包括染液、抑菌剂、核酸保护剂、细胞保护剂；所述染液、抗菌剂、核酸保护剂和细胞保护剂之间的质量比为95：2：2：1。

2.根据权利要求1所述的一种细胞保存卡，其特征在于：所述染液选自偶氮染料、蒽醌染料、芳甲烷染料、靛族染料、硫化染料、酞菁染料、硝基和亚硝基染料、甲川和多甲川类染料、二苯乙烯类染料以及杂环类染料中任一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种细胞保存卡，其特征在于：所述抑菌剂选自甲醛及其衍生物、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、重氮烷基脲、咪唑烷基脲中任一种或多种。

4.根据权利要求1所述的一种细胞保存卡，其特征在于：所述核酸保护剂选自肝素、金精三羧酸、甲酰胺、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸盐、dtt、ata中任一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种细胞保存卡，其特征在于：所述细胞保护剂选自甘氨酸、天冬氨酸、半胱酰胺、谷氨酰胺、甘油醛-3-磷酸中任一种或多种。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的一种细胞保存卡使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种细胞保存卡使用方法，其特征在于：所述步骤2中缓冲液为pbs。

8.一种如权利要求1所述的一种细胞保存卡在基因组扩增上的应用，其特征在于：细胞保存卡在单细胞全基因组扩增上应用。

9.根据权利要求8所述的一种细胞保存卡在基因组扩增上的应用，其特征在于：细胞保存卡在单细胞全基因组扩增上的应用包括扩增产物下游应用于荧光定量pcr、高通量测序，应用于snp检测、cnv检测相关下游应用。

技术总结
本发明一种细胞保存卡、使用方法及在基因组扩增上的应用，使用pH指示剂、抗菌剂、核酸保护剂将特质用纸染色、防腐、晾干后为细胞保存卡；通过流式细胞仪分选，缓冲液稀释，显微操作和激光显微切割获得单细胞，将细胞点于细胞保存卡上，晾干后将带有细胞的卡片打孔，并放置于无酶无菌管中；细胞通过裂解、预扩增、扩增的全流程即可获得最终产物。本细胞保存卡能够保存细胞1‑7天，并在细胞运输中保证其完整性，并能够使用单细胞扩增试剂盒扩增全基因组。细胞保存卡有效抑制杂菌生长，直观分辨细胞所在位置，防止核酸酶降解，解决了胚胎细胞运输费用高昂、运输过程繁琐、细胞破裂、后续扩增失败、细胞冻融后完整性损失的问题。

技术研发人员：管雪婷,齐明霞,何文龙
受保护的技术使用者：江苏康为世纪生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12