一种扩增引物、油莎豆中长粒粒型鉴定用试剂盒

本发明涉及分子生物学及遗传育种，具体涉及一种扩增引物、油莎豆中长粒粒型鉴定用试剂盒。

背景技术：

1、油莎豆起源于非洲，它具有亩产高、健康功效好、抗逆性强、不与主粮争地等突出优点。

2、现有的油莎豆种质资源中，其粒型基本可以分为中圆粒、中长粒、中长粒。茎豆颜色常见为棕黄色，黑色较为少见。油莎豆不同的粒型和茎豆颜色区分是油莎豆品质分类的主要表型依据之一，也是专收、专储、分类加工等产业化环节的基础。但由于油莎豆的研究基础非常薄弱，遗传学及基因组学发展滞后，至今仍没有参考基因组和重复性高的引物，不同粒型的油莎豆种质资源鉴定基本完全依赖于表型和考种鉴定。而表型鉴定存在时间周期长，鉴定结果易受环境和人为影响等问题。以dna分子标记为代表的分子生物学技术已充分小麦、水稻、玉米等主要粮食作物的性状检测中得以运用，而油莎豆遗传学研究起步晚、基础薄。目前，油莎豆仅有2个油分合成相关基因通过同源克隆的方法被成功发掘，吉林农科院开发了数个rapd标记对种质资源进行分类，河南省农业科学院经济作物研究所开发了部分kasp标记，以上标记尚未得到在种质资源中的充分验证，同时也无法和油莎豆的粒型性状建立联系。油莎豆中长粒茎豆这一重要形状的分子检测技术尚处于缺乏状态，为了更好完成科研和产业化任务，亟需通过筛选确定油莎豆中长粒粒型的分子检测标记，开发出能够用于区分出油莎豆中长粒粒型的分子诊断产品。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种扩增引物，靶向扩增如seq id no.1或seq id no.2所示序列。

2、本发明目的之二在于提供一种油莎豆中长粒粒型鉴定用试剂盒，包括本发明提供的扩增引物，靶向扩增如seq id no.1或seq id no.2所示序列，用于区分出中长粒粒型油莎豆。

3、为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

4、一种扩增引物，由第一扩增引物对或第二扩增引物对组成，其中第一扩增引物对靶向扩增如seq id no.1所示序列，第二扩增引物对靶向扩增如seq id no.2所示序列。

5、可选的，第一扩增引物对由正向引物和反向引物组成，正向引物序列为：5’-attttcacatagcgttgccc-3’；反向引物序列为：5’-cacgcggctaattaagctct-3’。

6、可选的，第二扩增引物对由正向引物和反向引物组成，正向引物序列为：5’-actgcttatgtgcttatcaaacc-3’；反向引物序列为：5’-ggaaacgttgttttcacttttt-3’。

7、进一步的，上述试剂盒还包括扩增反应用缓冲液。

8、更进一步的，所述扩增反应用缓冲液包括dna聚合酶、datp、dctp、dttp、dgtp。

9、上述油莎豆中长粒粒型鉴定用试剂盒的制备方法，包括首先筛选确定油莎豆中长粒粒型特异性分子标记，其筛选方法包括以下步骤：

10、1）测定并获取筛选样本的油莎豆基因组序列信息；

11、2）分子标记发掘与引物设计：进行ssr位点检测，筛选ssr序列，设计ssr引物，作为备选引物；进行indel位点筛选设计，筛选每个材料上下游100bp内不含snp/indel的特异性位点，针对特异性位点设计引物，作为备选引物；

12、3）筛选确定分子标记：使用步骤2）的备选引物扩增筛选样本，以单拷贝、重复性高，在染色体上均匀分布为标准，筛选出与中长型茎豆相关联的分子标记；

13、4）以步骤3）筛选确定的分子标记对应的扩增引物，组装获得所述试剂盒；

14、其中步骤3）筛选确定的分子标记为如seq id no.1和seq id no.2所示序列。

15、进一步的，步骤2）ssr位点检测按照以下配置参数使用软件 misa对基因组进行搜索，寻找其中的ssr：

16、配置参数信息：

17、definition ( unit_size,min_repeats ) :1-15 2-6 3-5 4-4 5-4 6-4

18、interruptions ( max_difference_between_2_ssrs ) : 100

19、以上述步骤找到的ssr序列为基础，利用软件primer3.0设计开发一批ssr引物；

20、其中步骤3）筛选确定两个分子标记，分别为如seq id no.1所示的分子标记和如seq id no.2所示的分子标记，该两个分子标记可以单独用于油莎豆中长粒粒型鉴定，也可组合使用鉴定油莎豆中长粒粒型；

21、其中如seq id no.1所示的分子标记对应的扩增引物由正向引物和反向引物组成，正向引物序列为：5’-attttcacatagcgttgccc-3’；反向引物序列为：5’-cacgcggctaattaagctct-3’；

22、其中如seq id no.2所示的分子标记对应的扩增引物由正向引物和反向引物组成，正向引物序列为：5’-actgcttatgtgcttatcaaacc-3’；反向引物序列为：5’-ggaaacgttgttttcacttttt-3’。

23、可选的，所述筛选样本的茎豆性状包括黑色、中圆粒、大粒、中长粒。

24、更进一步优选的，所述筛选样本中包括1种品种黑色；3种品种的中圆粒；3种品种的大粒；1种品种中长粒。

25、可选的，步骤1）测定并获取油莎豆基因组序列信息的具体方法包括：

26、（1）dna提取：采集幼嫩叶片，提取高质量、无降解、高纯度的基因组dna；

27、（2）文库构建：在亲和素磁珠的吸附下，捕获带有生物素的 dna，对 dna 片段进行末端修复、加 a、接头连接、评估pcr 扩增循环数、纯化出库的步骤完成整个文库制备；

28、（3）文库质控：文库构建完成后，先使用 qubit2.0 进行初步定量，稀释文库至 1ng/μl，随后使用 agilent 2100对文库的 insert size 进行检测， insert size 符合预期后，使用 q-pcr 方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量；

29、（4）上机测序：库检合格后，将不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling 后进行bgi mgiseq-2000 pe150 测序；

30、（5）获取序列信息：

31、步骤（4）得到的原始图像数据文件经碱基识别（base calling）分析转化为原始测序序列，经过数据质控、过滤和拼接处理后，获得油莎豆序列信息。

32、本发明通过对油莎豆种质资源中的代表性粒型的基因组测序，选取黑色、中圆粒、中长粒、中长粒为筛选样本，发掘了大批油莎豆ssr序列位点，并结合indel位点筛选，在上下游100bp内不含snp/indel的特异性位点设计引物，经过筛选单拷贝位点，设计单拷贝位点扩增引物对现有的油莎豆品系和家系、特色种质资源材料进行筛选鉴定，发现可以特异性用于区分中长粒粒型油莎豆的分子标记，并确定靶向扩增该分子标记的扩增引物，组装形成能够鉴定区分出中长粒粒型油莎豆品种的快速分子检测产品。经过本发明实施例验证，本发明试剂盒能够从多样混合的油莎豆品种中准确筛选出中长粒粒型品种。

33、进一步的，本发明筛选出两个能够特异性区分油莎豆中长粒粒型的分子标记，该两个分子标记可以单独使用，也可以组合使用，组合使用能够提高油莎豆中长粒粒型的鉴别准确性，降低错误率。

34、本发明试剂盒用于油莎豆品种快速鉴定具有以下优势：（1）检测成本低，在利用常规page检测技术时，单个样本检测成本在0.5元左右；（2）检测技术简单、易操作，检测通量方便灵活，可以根据检测需求，灵活调整；（3）对检测设备要求低，仅需要一台pcr仪和电泳设备即可；（4）用时短、重复性高、结果准确。