一种Ig重链重排MRD的检测试剂盒及检测方法与流程

本发明提供了一种基于免疫球蛋白重链(igh)高通量测序的淋系血液癌症如t/b系白血病、淋巴瘤、骨髓瘤微小残留病的检测方法。

背景技术：

1、绝大多数的淋系血液肿瘤起源于单个b细胞或者t细胞的无限增殖，其特征是存在免疫球蛋白(ig)或者t细胞(tr)受体基因的克隆性重排。b细胞受体(bcr)由两条重链和两条轻链，共四条肽链组成，重链由igh基因编码，轻链分别由igl(lamda链)和igk(kappa链)编码。igh基因的胚系基因由多个开放阅读框依次排列而成，可划分为ighv，ighd，ighj，ighc四组片段，在b淋巴细胞发育过程中通过体细胞重排实现不同片段间随机组合产生成熟的igh分子，同时在ighd-ighj，ighv-ighd的连接处，由于非模板核苷酸的随机插入与缺失，大大增加了bcr分子的多样性程度。正常人体内，igh呈多克隆状态，而在癌症患者体内，igh呈单克隆重排的状态。因此igh克隆性评估可作为重要的诊疗辅助手段，进行恶性淋系肿瘤的诊断与治疗。

2、当前euroclonality/biomed-2多重pcr结合异源双链核酸分析或者毛细管电泳的方法检测bcr重排，是淋系血癌克隆性评估的金标准，但该方法扩增子长度在150-440b，仅适用于质量较好的dna样本，对于dna质量较差的样本如ffpe样本，易造成由于目的产物太长而导致的漏检情况。同时，该方法仅通过片段大小区分是否发生克隆增生，无法获得准确序列，无法评估克隆进化的发生。

3、在过去几十年，高通量测序技术已成功应用于免疫学、血液学领域，包括bcr/tcr免疫组库的深度测序。但目前针对igh高通量测序方法存在如下问题：(1)由于基因突变导致根据胚系基因设计的多重pcr引物无法结合到目标序列，从而造成漏检。(2)覆盖v，j基因不全面造成克隆型漏检。

4、另外，更为重要的是：由于多重pcr引物间存在扩增效率的差异，如果不对体系进行优化校正则不能准确反应样本克隆的真实水平，导致mrd定量不准确。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：现有的基于多重pcr方法的igh重排检测方法中，由于癌症样本突变频率高，引物结合效率差，导致克隆型漏检，以及由于引物之间扩增效率差异而导致mrd定量结果不准确的问题。

2、本专利的方法中，针对已知igh参与重排的56个功能v基因，22个orf基因，及6个功能j基因片段的保守区域(fr1,fr2,fr3)设计特异性引物，扩增cdr3区域，检测癌细胞的同时发现新突变的癌细胞。通过采用了优化设计的内参标准品校正多重pcr引物扩增偏好，以达到无偏扩增的水平，同时结合生物信息学分析流程，准确鉴定测序过程中产生的癌细胞reads，真实反应样本克隆水平。

3、一种ig重链重排mrd的检测试剂盒，其中包含有如下引物：

4、针对fr1的上游引物组，引物序列如seq id no.1-8；

5、针对fr2的上游引物组：引物序列如seq id no.9-16；

6、针对fr3的上游引物组：引物序列如表seq id no.17-30。

7、一组下游引物：引物序列如seq id no.31-34。

8、还含有mpcr试剂multiplex pcr mix、nuclease-free water。

9、所述的试剂盒中，还包含内参dna标准品。

10、所述的内参dna标准品序列与igh重排的基因分型序列相匹配。

11、seq id no.1-34所示的引物之间的摩尔比依次优选为2:2:2:2:2:4:4:4:4:4:3:3:3:4:4:4:2:2:2:2:8:4:4:4:4:2:2:2:2:3:2:2:4:4。

12、所述的试剂盒中，还包含建库试剂盒。

13、一种ig重链重排mrd的检测方法，包括如下步骤：

14、步骤1，提取样本dna；

15、步骤2，通过上述的引物进行多重pcr扩增，将扩增产物进行建库；

16、步骤3，对文库进行高通量测序并对结果分析。

17、所述的步骤2中，还加入内参标准品进行扩增。

18、所述的步骤3中，通过如下步骤计算出mrd定量值：

19、定量计算公式为mrd＝(rc/(rref/nref)/2)/n，其中，rc是测序所得癌细胞的reads数，rref是测序所得内参序列的reads数，nref是添加内参的分子数，n＝m/k，n是总有核活细胞的数量，m是总有核活细胞的质量，k为每个细胞dna总量约为6.53pg。

20、有益效果

21、(1)通过在ighv三个保守区域fr1,fr2,fr3三个区域设计多重pcr引物，引物覆盖56个功能v，22个orfv，6个功能j基因，最大程度减少了由于序列突变导致的漏检概率。同时，引物设计时充分评估引物数量与目标产物覆盖度平衡性，以最少引物扩增尽可能多的产物，减少由于引物过多造成扩增效果差。

22、(2)利用优化设计的最大程度模拟igh组库的标准品对引物浓度进行多次调整校正，达到无偏扩增的目的，精确反应样本的真实克隆水平。

23、(3)本试剂盒利用合成的内参模拟igh v-j重排，检测结果稳定，通过内参来量化癌细胞占比，该方法对于确保临床mrd结果的准确性至关重要。

24、(4)本方法mrd检测结果与金标准流式细胞术高度一致，同时，检测灵敏度提高了2个数量级，至少可达10-6，即100万个细胞中检测到一个癌细胞。

技术特征：

1.一种ig重链重排mrd的检测试剂盒，其特征在于，其中包含如下引物：

2.根据权利要求1所述的ig重链重排mrd的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中，还包含内参dna。

3.根据权利要求1所述的ig重链重排mrd的检测试剂盒，其特征在于，所述的内参dna序列与igh重排的基因分型序列相匹配。

4.根据权利要求1所述的ig重链重排mrd的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中，还包含建库试剂盒。

5.根据权利要求1所述的ig重链重排mrd的检测试剂盒，其特征在于，seq id no.1-34所示的引物之间的摩尔比依次优选为2:2:2:2:2:4:4:4:4:4:3:3:3:4:4:4:2:2:2:2:8:4:4:4:4:2:2:2:2:3:2:2:4:4。

6.一种ig重链重排mrd的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的ig重链重排mrd的检测方法，其特征在于，所述的步骤2中，还加入内参dna进行扩增。

8.根据权利要求6所述的ig重链重排mrd的检测方法，其特征在于，所述的步骤3中，通过如下步骤计算出mrd定量值：定量计算公式为mrd＝(rc/(rref/nref)/2)/n，其中，rc是测序所得癌细胞的reads数，rref是测序所得内参序列的reads数，nref是添加内参的分子数，n＝m/k，n是总有核活细胞的数量，m是总有核活细胞的质量，k为每个细胞dna总量。

技术总结
本发明提供了一种基于免疫球蛋白重链(IGH)高通量测序的淋系血液癌症如T/B系白血病、淋巴瘤、骨髓瘤微小残留病的检测方法，该方法针对IGH FR1、FR2、FR3区域设计三组上游引物，搭配IGHJ一组下游引物，针对性对IGH CDR3区域进行多重PCR扩增，PCR产物回收后进行文库构建，将所得DNA文库进行高通量测序，通过生物信息学方法对测序结果进行分析。本方法利用人工合成的内参标准品对多重PCR引物扩增偏好进行校正，确保最大程度降低PCR过程中引入的误差而导致MRD定量的不准确，本方法MRD检测结果与金标准流式细胞术高度一致，同时，检测灵敏度提高了2个数量级，至少可达10<supgt;‑6</supgt;，即100万个细胞中检测到一个癌细胞。

技术研发人员：邵阳,宋晓雯,林显祖,刘思思,朱柳青,何鹏
受保护的技术使用者：南京世和基因生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29