靶分析物测定方法、突变CsgG单体及其构筑体、及聚核苷酸和寡聚孔与流程

本发明涉及csgg的突变形式。本发明还涉及使用csgg的分析物检测和表征。

背景技术：

1、纳米孔感测是一种依赖于观测分析物分子与受体之间的个别结合或相互作用事件的感测方法。可通过在绝缘膜中放置纳米尺寸单孔和测量在分析物分子存在下通过孔的电压驱动的离子转运来产生纳米孔传感器。通过分析物的独特电流标志来揭露分析物的特性，值得注意的是，电流块的持续时间和程度以及电流电平的变化。此类纳米孔传感器是可商购的，如由牛津纳米孔科技有限公司(oxford nanopore technologies ltd)销售的miniontm装置，其包含与电子芯片集成的纳米孔阵列。

2、目前仍需要横跨广泛应用范围的快速且廉价的核酸(例如dna或rna)测序技术。现有技术缓慢且昂贵，这主要是因为其依赖于扩增技术来产生大体积的核酸且需要大量的用于信号检测的专业荧光化学试剂。纳米孔感测具有通过降低核苷酸和所需的试剂的数量来提供快速且廉价的核酸测序的潜能。

3、使用纳米孔感测进行核酸测序的两个基本组分是(1)控制通过孔的核酸移动和(2)在核酸聚合物通过孔移动时鉴别核苷酸。在过去，为了实现核苷酸鉴别，核酸已通过溶血素突变。这提供了已表明为序列依赖性的电流标志。还表明，大量的核苷酸引起当使用溶血素孔时所观测的电流，使得在所观测的电流与聚核苷酸问题之间具有直接关系。

4、虽然用于核苷酸鉴别的电流范围已通过溶血素孔突变来改进，但如果核苷酸之间的电流差异可以进一步改进，那么测序系统将具有更高个性能。另外，已观测到，当核酸通过孔移动时，一些电流状态显示很高的变化。还表明，一些突变溶血素孔比其它的显示更高的变化。虽然这些状态的变化可含有序列特异性信息，但期望生产具有低变化的孔以简化系统。还期望降低引起所观测电流的核苷酸数量。

技术实现思路

1、本发明人已出人意料地证实，csgg和其新颖突变可用于表征分析物，如聚核苷酸。本发明涉及突变csgg单体。本发明人已出人意料地证实，包含新颖突变单体的孔具有增强的评估分析物特征的能力，如聚核苷酸的序列。本发明人已制备出出人意料地提供靶聚核苷酸相对于，如通过孔更加一致移动的突变孔。本发明人已制备出出人意料地显示改进的表征准确度的突变孔。特定来说，本发明人已制备出出人意料地显示电流范围增加和状态变化降低的突变孔，所述增加的电流范围使得更容易在不同核苷酸之间进行鉴别，所述状态变化降低增加信噪比。另外，本发明人已制备出出人意料地更容易捕获核苷酸和聚核苷酸的突变孔。在突变csgg单体中，位置192处的精氨酸(r)可被天冬氨酸(d)、谷氨酰氨(q)、苯丙氨酸(f)、丝氨酸(s)或苏氨酸(t)取代。本发明人已出人意料地证实，此类单体且特定来说包含r192d取代的单体比在192位置处无取代的单体容易表达许多。

2、除非相反地陈述，否则本文所公开的所有氨基酸取代、缺失和/或添加均是参考包含seq id no:2中所示序列的变异体的突变csgg单体。

3、提及包含seq id no:2中所示序列的变异体的突变csgg单体，涵盖包含如在如下文所公开的其它seq id no中陈述的序列变异体的突变csgg单体。可对包含除seq id no:2中所示以外的序列变异体的csgg单体，进行等效于本文所公开的参考包含seq id no:2中所示序列的变异体的突变csgg单体的那些取代、缺失和/或添加的氨基酸取代、缺失和/或添加。

4、突变单体可被视为经分离单体。

5、特定来说，本发明涉及其中位置97处的精氨酸(r)已被色氨酸(w)取代、其中位置93处的精氨酸(r)已被色氨酸(w)取代、其中位置93和97处的精氨酸(r)已被色氨酸(w)取代的突变csgg单体。

6、本发明还提供一种突变csgg单体，其包含seq id no:2中所示序列的变异体，其中所述变异体包含(a)f191t，(b)v105、a106和i107的缺失和/或r192、f193、i194、d195、y196、q197、r198、l199、l200和e201位置中的一或多个的缺失，如f193、i194、d195、y196、q197、r198和l199的缺失或d195、y196、q197、r198和l199的缺失。

7、本发明还提供：

8、-包含seq id no:2中所示序列的变异体的突变csgg单体，所述突变csgg单体包含r192d/q/f/s/t；

9、-突变csgg单体，其包含(a)r192d；(b)r97w/y和/或r93w/y，优选地r97w、r93w或r93y和r97y；(c)k94q/n；(d)g103k/r和/或t104k/r；和/或(e)f191t，v105、a106和i107的缺失和/或f193、i194、d195、y196、q197、r198和l199的缺失。

10、突变csgg单体优选地进一步包含y51a和f56q。

11、由本发明提供的特定突变csgg单体包含seq id no:2中所示序列的变异体，所述变异体包含以下突变：

12、(1)y51a、f56q和r192d；

13、(2)y51a、f56q和r97w。

14、(3)y51a、f56q、r192d和r97w；

15、(4)y51a、f56q、r192d和r93w；

16、(5)y51a、f56q、r192d、r93y和r97y；或

17、(6)y51a、f56q、r192d和r93w。

18、(7)根据(1)-(6)中任一项所述的突变，和：

19、(a)v105、a106和i107的缺失。

20、(b)k94q或k94n；

21、(c)d195、y196、q197、r198和l199的缺失或f193、i194、d195、y196、q197、r198和l199的缺失；和/或

22、(d)f191t。

23、(8)根据(1)-(6)中任一项所述的突变，和：

24、(i)k94q和v105、a106和i107的缺失；

25、(ii)k94n和v105、a106和i107的缺失；

26、(iii)f191t和v105、a106和i107的缺失；

27、(iv)k94q和f191t；

28、(v)k94n和f191t；

29、(vi)k94q、f191t和v105、a106和i107的缺失；或

30、(vii)k94n、f191t和v105、a106和i107的缺失。

31、(9)根据(1)-(8)中任一项所述的突变，和：

32、-t104k或t104r；

33、-l90r；

34、-n91r；

35、-i95r；

36、-a99r；

37、-e101k、e101n、e101q、e101t或e101h；

38、-e44n或e44q；和/或

39、-q42k。

40、本发明还提供：

41、-一种构筑体，其包含两个或更多个共价连接的csgg单体，其中所述单体中的至少一个是本发明的突变单体；

42、-一种聚核苷酸，其编码本发明的突变单体或本发明的构筑体；

43、-一种同源寡聚孔，其衍生自csgg，所述同源寡聚孔包含相同的本发明的突变单体或相同的本发明的构筑体；

44、-一种异源寡聚孔，其衍生自csgg，所述异源寡聚孔包含至少一个本发明的突变单体或至少一个本发明的构筑体；

45、-一种用于测定靶分析物是否存在或其一或多个特征的方法，其包含：

46、(a)使靶分析物与本发明的孔接触，使得靶分析物相对于孔移动；和

47、(b)在所述分析物相对于所述孔移动时，进行一或多个测量，且从而测定所述分析物是否存在或其一或多个特征；

48、-一种形成用于表征靶聚核苷酸的传感器的方法，其包含在本发明的孔与聚核苷酸结合蛋白之间形成复合体且从而形成用于表征靶聚核苷酸的传感器；

49、-一种用于表征靶聚核苷酸的传感器，其包含本发明的孔与聚核苷酸结合蛋白之间的复合体；

50、-一种本发明的孔的用途，其用于测定靶分析物是否存在或其一或多个特征；

51、-一种用于表征靶分析物的试剂盒，其包含(a)本发明的孔和(b)膜组分；

52、-一种用于表征样本中的靶分析物的设备，其包含(a)多个本发明的孔和(b)多个膜；

53、-一种表征靶聚核苷酸的方法，其包含：

54、a)使聚核苷酸与本发明的孔、聚合酶和标记核苷酸接触，使得磷酸标记物种通过聚合酶依序添加到靶聚核苷酸中，其中磷酸物种含有对各核苷酸具有特异性的标记；和

55、b)使用所述孔检测所述磷酸标记物种，且从而表征所述聚核苷酸；和

56、-一种生产本发明的突变单体或本发明的构筑体的方法，其包含在合适宿主细胞中表达本发明的聚核苷酸且从而生产本发明的突变单体或构筑体。