一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法与流程

本发明属于微生物发酵，涉及一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法。

背景技术：

1、吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，pqq)，是生物体内参与脱氢酶氧化还原反应的辅酶，参与呼吸链电子传递，具有促进机体生长、防护肝损伤、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、提高细胞对毒性和辐射等极端条件耐受性的功能，是一种独特的生理活性物质，在食品和医药保健领域具有重要的开发前景。

2、pqq虽然广泛存在于自然界中，但哺乳动物自身却不合成。其中植物含量低、提取成本太高，不适合工业化生产；化学合成法反应复杂，副产物多，成本较高，目前国内外pqq的生产大多采用微生物发酵法。微生物发酵法有如下优点：(1)产品为天然产物，生物活性好，易于人体吸收；(2)原料来源广泛，利于工业化生产。

3、提高pqq的发酵产量主要从两个方面进行优化：一是通过自然筛选、诱变育种或基因工程等手段选育出pqq高产菌株，二是优化发酵培养基和发酵工艺，提高菌株的生长和产物合成水平。确定生产菌株及发酵培养基后，在摇瓶及发酵罐实验阶段可通过单因素等统计学的方法来进行优化，然而在生产上利用这一手段去优化时情况较复杂且工作量大，微生物发酵周期长，发酵结果不稳定，重复性低，效率较低。

4、cn106282044b公开了一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法，该发明公开的培养基以甲醇为单一碳源，发酵过程补料工艺粗放简陋，不易于控制，最终pqq发酵浓度虽然达到了1783mg/l，但是甲醇消耗较多，转化率较低。

5、cn112375792a公开了一种生物法制造pqq的方法，该发明公开了一种利用生丝微菌发酵生产pqq的工艺，通过在培养过程中补加香菇多糖、枸杞多糖、大豆异黄酮等额外组分，促进菌体的生长和pqq产量的提高，最终pqq发酵浓度达到340.5mg/l，od650达到25，该发明通过补料提高了pqq的发酵水平，但整体产量较低，发酵成本较高，不利于工业化推广。

6、因此，在本领域中，期望开发一种既能够提高产量，又能够降低发酵成本的pqq生产方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法。本发明的制备方法能够有效延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高了生丝微菌积累pqq产物的速率，提高了pqq发酵水平，降低了其生产成本。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将生丝微菌经菌种活化、摇瓶培养、种子培养后接种到发酵培养基进行发酵培养，在发酵培养阶段进行如下控制：

4、(1)发酵初期菌型为梭形，控制甲醇浓度为5～10g/l；

5、(2)当菌体出现二分裂时，控制甲醇浓度为5～10g/l；

6、(3)当菌体的极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/l；当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/l；当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/l，之后停止发酵。

7、本发明中，发明人在研究过程中发现，当生丝微菌的极生菌丝的长度维持约为2～5倍菌体长度的阶段越长，产物pqq的比产率越高，并据此发明了本发明的发酵方法，能够有效延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高了生丝微菌积累pqq产物的速率，提高了pqq发酵水平，降低了其生产成本。

8、在本发明中，通过根据菌体菌型调整甲醇浓度，使得延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高生物量和产物产量。本发明的特征在于，在发酵培养基进行发酵培养阶段。

9、在本发明中，所述菌体的菌型是通过olympus cx23显微镜观察获知。

10、在本发明中，发酵初期菌型为梭形，此时极生菌丝长度为约1倍菌体长度，此时控制甲醇浓度为5～10g/l，例如5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l。如果在该时期甲醇浓度低于5g/l，则菌体生长速度缓慢，菌浓od650较低，造成pqq产量偏低，如果甲醇浓度高于10g/l，则对菌体产生毒害作用，抑制菌体生长，造成pqq产量偏低。

11、经过发酵初期后，菌体会大量出现二分裂，在菌体出现二分裂阶段也是控制甲醇浓度为5～10g/l，例如5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l。如果在该时期甲醇浓度低于5g/l，则菌体生长速度缓慢，菌浓od650较低，造成pqq产量偏低，如果甲醇浓度高于10g/l，则对菌体产生毒害作用，抑制菌体生长，造成pqq产量偏低。

12、而后菌体的极生菌丝长度达到2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/l，例如3g/l、3.5g/l、4g/l、4.5g/l、5g/l、5.5g/l或6g/l。如果在该时期甲醇浓度低于3g/l，则会碳源不足，从而影响菌体生长和产物合成，造成pqq产量偏低，如果甲醇浓度高于6g/l，则会抑制pqq分泌至培养基，造成pqq产量偏低。

13、当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/l，例如0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l或1g/l，如果在该时期甲醇浓度低于0.5g/l，则会碳源不足，从而影响菌体生长和产物合成，造成pqq产量偏低，如果甲醇浓度高于1g/l，则会抑制pqq分泌至培养基，造成pqq产量偏低。

14、当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/l，例如0.5g/l、0.4g/l、0.3g/l、0.2g/l或0.1g/l等，之后停止发酵。如果在该时期甲醇浓度高于0.5g/l，则会造成pqq被消耗，产量偏低，并且造成发酵液中甲醇残留，可能影响后期发酵液提炼。

15、优选地，步骤(1)中通气量为0.6～0.8vvm(例如0.65vvm、0.7vvm或0.75vvm)，压力控制在0.05～0.06mpa(例如0.055mpa、0.058mpa或0.06mpa)，转速为120～140rpm(例如120rpm、125rpm、130rpm或135rpm)，ph 6.5～7.0(例如6.5、6.7、6.9或7.0)，温度为25～35℃(例如25℃、28℃、30℃、33℃或35℃)。

16、优选地，步骤(2)中通气量为0.8～1.4vvm(例如0.85vvm、0.9vvm、1.0vvm、1.2vvm或1.3vvm)，压力控制在0.06～0.08mpa(例如0.065mpa、0.07mpa或0.075mpa)，转速为200～250rpm(例如220rpm、230rpm或240rpm)，ph 6.5～7.0(例如6.5、6.7、6.9或7.0)。

17、优选地，步骤(3)中通气量为1.4～2.0vvm(例如1.5vvm、1.6vvm、1.7vvm、1.8vvm或1.9vvm)，压力控制在0.05～0.06mpa(例如0.055mpa、0.058mpa或0.06mpa)，转速180～200rpm(例如185rpm、190rpm或195pm)，ph 6.5～7.0(例如6.5、6.7、6.9或7.0)。

18、优选地，所述生丝微菌为甲醇利用型脱单生丝微菌。

19、在本发明中，所述甲醇利用型脱单生丝微菌为脱单生丝微菌hyphomicrobiumdenitrificans cgmcc1.15943。

20、优选地，所述发酵培养的培养基的组分为：硫酸铵1.5～5.5g/l(例如2.0g/l、3.5g/l、4.0g/l、4.5g/l或5g/l)，磷酸二氢钾1～4g/l(例如1.5g/l、2g/l、2.5g/l或3g/l)，磷酸氢二钠2.5～5.5g/l(例如3.5g/l、4.0g/l、4.5g/l或5g/l)，硫酸镁0.5～2g/l(例如0.8g/l、1.0g/l、1.5g/l或1.8g/l)，丝氨酸0.1～0.5g/l(例如0.2g/l、0.3g/l或0.4g/l)，含微量元素的复合成分1～5ml/l(例如2ml/l、3ml/l、3.5ml/l、4ml/l或4.5ml/l)，辅液1～5ml/l(例如2ml/l、3ml/l、3.5ml/l、4ml/l或4.5ml/l)，甲醇5～10g/l(例如6g/l、7g/l、8g/l或9g/l)。

21、优选地，所述含微量元素的复合成分包括如下组分：硫酸亚铁4～8g/l(例如5g/l、6g/l、7g/l或7.5g/l)，硫酸锌20～30g/l(例如23g/l、25g/l或28g/l)，硫酸锰4～8g/l(例如5g/l、6g/l、7g/l或7.5g/l)，硫酸铜0.5～2g/l(例如0.8g/l、1.0g/l、1.5g/l或1.8g/l)，氯化钠1～5g/l(例如2g/l、3g/l或4g/l)，钼酸钠25～40mg/l(例如28mg/l、30mg/l、35mg/l或38mg/l)，氯化钴25～40mg/l(例如28mg/l、30mg/l、35mg/l或38mg/l)，氯化钙25～40mg/l(例如28mg/l、30mg/l、35mg/l或38mg/l)，氯化镁0.1～1.2g/l(例如0.2g/l、0.5g/l、0.8g/l或1.0g/l)。

22、优选地，所述辅液包括如下组分：核黄素0.1～0.4g/l(例如0.2g/l、0.3g/l或0.35g/l)、盐酸硫胺0.3～0.6g/l(例如0.4g/l、0.5g/l或0.55g/l)、烟酸0.3～0.6g/l(例如0.4g/l、0.5g/l或0.55g/l)、生物素0.01～0.04g/l(例如0.02g/l、0.03g/l或0.04g/l)、肌醇1～4g/l(例如1.5g/l、2g/l、2.5g/l或3g/l)。

23、优选地，所述发酵培养的培养基中除辅液和甲醇之外，调节消前ph 6.5～7.0，于121℃灭菌25～30min，将辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。

24、优选地，所述种子培养至od650值为2～6时，接种到发酵培养基，接种量为5～10％，例如5％、6％、7％、8％、9％或10％。

25、在本发明中，所述菌种活化、摇瓶培养、种子培养均采用常规的方法进行。

26、优选地，所述菌种活化的平板培养基的组分为：硫酸铵2～6g/l，磷酸二氢钾1～4g/l，磷酸氢二钠2～6g/l，硫酸镁0.5～2g/l，微量元素0.5～2ml/l，辅液0.5～2ml/l，甲醇10～20g/l，琼脂粉20～30g/l。

27、优选地，所述平板培养基中除辅液和甲醇之外，调节消前ph 6.5～7.0，于121℃灭菌25～30min，将辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。

28、在本发明中，从平板上挑取菌落生长饱满有光泽，形状呈圆形且边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落，加1ml无菌水打散混匀，稀释到一定梯度后吸取少量菌液于平板上进行涂布，于25～35℃培养5～9天。

29、优选地，所述摇瓶培养的培养基的组分为：硫酸铵2～6g/l，磷酸二氢钾1～4g/l，磷酸氢二钠2～6g/l，硫酸镁0.5～2g/l，微量元素0.5～2ml/l，辅液0.5～2ml/l，甲醇10～20g/l。

30、优选地，所述摇瓶培养的培养基中除辅液和甲醇之外，调节消前ph 6.5～7.0，于121℃灭菌25～30min，将辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。

31、在本发明中，从平板培养后的平板上挑取10～20个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落装于10ml无菌水试管充分打散，每个摇瓶接2～4ml菌悬液，培养条件为转速220～240rpm，培养温度25～35℃，培养周期为32～46h。

32、优选地，所述种子培养的培养基的组分为：硫酸铵1.5～5.5g/l，磷酸二氢钾1～4g/l，磷酸氢二钠2.5～5.5g/l，硫酸镁0.5～2g/l，微量元素1～5ml/l，辅液1～5ml/l，甲醇10～20g/l。

33、优选地，所述种子培养的培养基中除辅液和甲醇之外，调节消前ph 6.5～7.0，于121℃灭菌25～30min，将辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。

34、在本发明中，待摇瓶培养至od650值为2～4之间即可移入种子罐，接种量为5％～10％，甲醇初始为10～20g/l，种子罐培养条件为罐压0.05～0.06mpa，罐温25～35℃，通气量0.6～0.8vvm，ph6.5～7.0，转速120～180rpm，培养周期为40～48h。

35、在本发明中，所述“消前”调节ph在本领域是指在培养基进行蒸汽高温灭菌前的一个操作，一般都在灭菌前操作。

36、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

37、本发明的制备方法根据生丝微菌在发酵过程中菌型变化，通过观察发酵过程中菌体极生菌丝的形成和菌体形态的变化，并以菌型作为判断工艺参数调整的时间及幅度的依据，通过根据不同菌型变化以及极生菌丝长度来控制甲醇浓度的变化，能够有效延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高了生丝微菌积累pqq产物的速率，工艺具有易控制性及简便性，稳定性好，从而使pqq发酵水平有了大幅度的提升，生产水平稳定，并且降低了其生产成本。