KLHL34敲除细胞系的构建及作为小RNA病毒科病毒生产细胞系的应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种klhl34敲除细胞系的构建及作为小rna病毒科病毒生产细胞系的应用。

背景技术：

1、小核糖核酸(rna)病毒科(picomaviridae)是由rna病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属等。口蹄疫(foot-and-mouthdis ease，fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，fmdv)引起的急性、热性、高度接触性传染的动物疫病，严重危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。fmdv是单股正链rna病毒，属于小rna病毒科口蹄疫病毒属，有o、a、c、sat1、sat2、sat3和asia1 7个血清型，且各型之间没有交叉免疫保护，即使同一血清型不同毒株抗原之间交叉免疫保护也存在差异。因其基因组为单股正链rna，具有很高的变异性，易产生新毒株，导致疫苗不能完全覆盖田间流行毒株，这就给口蹄疫的免疫防控带来巨大挑战。开发高效疫苗是当前防控该病最有效的举措，而选取病毒高效繁殖的细胞系是制备高效疫苗的前提，急需开展相关工作。

2、crispr-cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。基于原核生物的适应性免疫防御系统研发出了crispr-cas9基因编辑技术，该技术就是通过人工设计的sgrna来识别目的基因组序列，并引导cas9蛋白酶进行有效切割dna双链，形成双链断裂。通常情况下，细胞会采用非同源末端连接(non-homologous end joining,nhej)或同源重组修复(homology-directedrepair,hdr)途径来对造成的断裂进行修复，实现基因的敲除与修饰。前者在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现特定基因的敲除。

3、klhl34是kelch样(klhl)基因家族的一员，它编码一组具有btb/poz结构域、ba ck结构域和5-6个kelch基序的蛋白质。perez-torrado等人论述了btb/poz结构域促进与其他蛋白质的结合，其功能涉及多种细胞内分子机制，包括细胞骨架组织的控制、离子通道的选择等，某些klhl基因的突变会导致孟德尔疾病或人类癌症。

4、本发明意外发现，抑制宿主细胞中klhl34基因的表达能促进小rna病毒科病毒的复制，尤其是fmdv的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向klhl34基因的sgrna，所述的sgrna能够特异性靶向klhl34基因，结合crispr-cas9技术实现了klhl34基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小rna病毒的复制，尤其是fmdv的复制，提高小rna病毒疫苗的生产量和抗原产量，可作为小rna病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景；而且所述的klhl34蛋白能够显著抑制口蹄疫病毒的复制，可用于预防或治疗口蹄疫病毒感染。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明首先发现，抑制宿主细胞中klhl34基因的表达能促fmdv的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向klhl34基因的sgrna，所述的sgrna能够特异性靶向klhl34基因，结合crispr-cas9技术实现了klhl34基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进fmdv的复制，提高fmdv疫苗的生产量和抗原产量，可作为fmdv疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一种klhl34蛋白或表达klhl34蛋白的重组载体/质粒在制备预防或治疗小rna病毒科病毒感染药物中的应用。

3、优选地，所述小rna病毒科病毒为口蹄疫病毒。

4、第二方面，本发明提供了一种klhl34基因编码蛋白功能丧失细胞系作为小rna病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系的应用。

5、优选地，所述小rna病毒科病毒为口蹄疫病毒。

6、第三方面，本发明提供了一种抑制或者沉默klhl34基因表达的试剂在制备小rna病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系中的应用。

7、优选地，所述小rna病毒科病毒为口蹄疫病毒。

8、优选地，所述试剂包括靶向敲除klhl34基因的sgrna，或靶向敲除klhl34基因的sgrna与cas9蛋白的mrna序列。

9、优选地，所述sgrna包括klhl34-sgrna-1和/或klhl34-sgrna-2；

10、所述klhl34-sgrna-1的靶向序列为：ttgacgtgtacaaccaccgc；

11、所述klhl34-sgrna-2的靶向序列为：ggcgtcgtgtacatctccgg。

12、优选地，所述klhl34-sgrna-1由klhl34-sgrna-1-f和klhl34-sgrna-1-r退火形成的双链；所述klhl34-sgrna-2由klhl34-sgrna-2-f和klhl34-sgrna-2-r退火形成的双链；

13、klhl34-sgrna-1-f：5’-caccgttgacgtgtacaaccaccgc-3’；

14、klhl34-sgrna-1-r：5’-aaacgcggtggttgtacacgtcaac-3’；

15、klhl34-sgrna-2-f：5’-caccgggcgtcgtgtacatctccgg-3’；

16、klhl34-sgrna-2-r：5’-aaacccggagatgtacacgacgccc-3’。

17、第四方面，本发明提供了一种特异性靶向klhl34基因的sgrna，所述sgrna包括klhl34-sgrna-1和/或klhl34-sgrna-2；

18、所述klhl34-sgrna-1的靶向序列为：ttgacgtgtacaaccaccgc；

19、所述klhl34-sgrna-2的靶向序列为：ggcgtcgtgtacatctccgg。

20、优选地，所述klhl34-sgrna-1由klhl34-sgrna-1-f和klhl34-sgrna-1-r退火形成的双链；所述klhl34-sgrna-2由klhl34-sgrna-2-f和klhl34-sgrna-2-r退火形成的双链；

21、klhl34-sgrna-1-f：5’-caccgttgacgtgtacaaccaccgc-3’；

22、klhl34-sgrna-1-r：5’-aaacgcggtggttgtacacgtcaac-3’；

23、klhl34-sgrna-2-f：5’-caccgggcgtcgtgtacatctccgg-3’；

24、klhl34-sgrna-2-r：5’-aaacccggagatgtacacgacgccc-3’。

25、第五方面，本发明提供了上述第四方面所述的sgrna在敲除klhl34基因或在制备kl hl34基因敲除细胞系中的应用。

26、第六方面，本发明提供了一种用于敲除klhl34基因的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述第四方面所述的sgrna，或靶向敲除klhl34基因的打靶载体；所述靶向敲除klhl34基因的打靶载体包括上述第四方面所述的sgrna和cas9蛋白基因的编码序列。

27、第七方面，本发明提供了一种klhl34基因编码蛋白功能丧失细胞系的构建方法，所述方法为：通过基因打靶技术使宿主细胞中klhl34基因编码蛋白功能丧失。

28、优选地，所述方法为crispr-cas9技术。

29、优选地，所述crispr/cas9系统使用上述第四方面所述的sgrna。

30、第八方面，本发明提供了一种klhl34基因编码蛋白功能丧失pk-15细胞系，所述pk-15细胞系的构建方法包括以下步骤：

31、(1)制备上述第四方面所述的特异性靶向klhl34基因的sgrna；

32、(2)将步骤(1)制备的sgrna退火并连接至px459质粒，得到同时表达cas9蛋白基因和打靶sgrna序列的重组质粒；

33、(3)将步骤(2)制备的重组质粒转染pk-15细胞，用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选以及细胞有限稀释法获得klhl34基因功能缺失细胞系。

34、本发明的有益效果是：①本发明首先发现，抑制宿主细胞中klhl34基因的表达能促进小rna病毒科病毒fmdv的复制；②所述的klhl34蛋白能够抑制小rna病毒科病毒fm dv的复制，可用于预防或治疗小rna病毒科病毒fmdv感染；③本发明提供了一种靶向klhl34基因的sgrna，所述sgrna能够特异性靶向klhl34基因，结合crispr-cas9技术可实现宿主细胞中klhl34基因的敲除，打靶准确、敲除效率高；④本发明提供了一种通过crispr-cas9技术将所述sgrna转染于宿主细胞，构建klhl34基因编码蛋白功能丧失细胞系的方法；⑤依据本发明所述方法获得的单克隆细胞系能够显著促进小rna病毒科病毒fm dv的复制，提高小rna病毒科病毒fmdv疫苗的生产量和抗原产量，可作为小核糖核酸病毒科病毒或病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。