一种表达HSP70的重组乳酸菌及其制备方法与应用与流程

本发明属于基因工程及分子免疫学，具体涉及一种表达hsp70的重组乳酸菌及其制备方法与应用。

背景技术：

1、多子小瓜虫(ichthyophthirius multifiliis,ich)属于纤毛虫纲、膜口目、凹口科、小瓜虫属，几乎能感染所有的淡水鱼类，分为掠食体、包囊前体、包囊和滋养体阶段，其中掠食体钻入鱼类皮肤表面后，分解鱼体表面黏液和上皮组织为食，可以造成鳞片基部和鳃盖处发生局灶性出血，并在真皮层中积聚血细胞和炎性结节。小瓜虫入侵鱼类表皮后，周围的白细胞和炎性细胞不仅没有诱导免疫保护，还被寄生虫摄取，导致炎症细胞的数量减少了，进而造成更加严重的继发性感染，也为小瓜虫病的防控带来巨大困难。因此，发病后常常引发鱼群大规模死亡并造成了巨大的经济损失。目前小瓜虫病的防治方法主要有物理方法和化学方法，但均不能对小瓜虫感染发挥有效控制作用。因此研制既能够确保水产品质量安全、环境友好，且操作简便、易于应用的绿色渔药，是促进我国水产养殖健康发展的当务之急。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种重组乳酸菌。

2、本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的重组乳酸菌的制备方法。

3、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的重组乳酸菌的应用。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。

5、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

6、本发明的第一个方面，提供一种重组乳酸菌，所述重组乳酸菌包含hsp70蛋白的编码基因，所述hsp70蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示的hsp70蛋白。

7、优选地，所述编码基因的序列如seq id no.3所示。

8、优选地，所述乳酸菌选自乳球菌亚种、链球菌亚种、乳杆菌亚种、明串珠菌亚种、片球菌亚种、短杆菌亚种以及丙酸杆菌亚种。

9、优选地，所述乳酸菌包含乳酸乳球菌；进一步包含乳酸乳球菌nz9000。

10、优选地，所述重组乳酸菌的名称为pnz8148-hsp70/l.lactis，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月27日；保藏编号是cctccno：m2023213，分类命名为：lactococcus lactis pnz8148-hsp70(乳酸乳球菌pnz8148-hsp70)。

11、本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的重组乳酸菌的制备方法，将hsp70蛋白的编码基因导入乳酸菌中。

12、优选地，所述hsp70蛋白的编码基因通过重组载体导入乳酸菌。

13、优选地，所述重组载体为将所述hsp70蛋白的编码基因插入表达载体的多克隆位点后得到的载体。

14、优选地，所述表达载体可为现有技术中常见的表达载体，例如：pnz8148、pnz8048、pnz9530、pnz8149、pleiss、pnz2013、pnz2103、pleb590、pnz8112、piaβ5、pw425e t、pw425t、pw425等。

15、优选地，所述表达载体为pnz8148。

16、优选地，所述导入的方式为电转化。

17、本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的重组乳酸菌在制备产品中的应用；所述产品具有c1)～c2)中至少一种功能：

18、c1)预防小瓜虫感染；

19、c2)治疗和/或预防小瓜虫感染所引起的疾病。

20、优选地，所述小瓜虫为多子小瓜虫；进一步为淡水鱼多子小瓜虫。

21、优选地，所述小瓜虫感染所引起的疾病为小瓜虫病。

22、优选地，所述产品包含饲料、饲料添加剂、药物、试剂中的至少一种。

23、优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

24、优选地，所述产品为口服制剂。

25、优选地，所述产品的施用对象为水产动物；进一步为淡水鱼；更进一步为草鱼。

26、本发明的第四个方面，提供一种产品，包含本发明第一个方面的重组乳酸菌。

27、优选地，所述产品具有c1)～c2)中至少一种功能：

28、c1)预防小瓜虫感染；

29、c2)治疗和/或预防小瓜虫感染所引起的疾病。

30、优选地，所述小瓜虫为多子小瓜虫；进一步为淡水鱼多子小瓜虫。

31、优选地，所述小瓜虫感染所引起的疾病为小瓜虫病。

32、优选地，所述产品包含饲料、饲料添加剂、药物、试剂中的至少一种。

33、优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

34、优选地，所述产品为口服制剂。

35、优选地，所述产品的施用对象为水产动物；进一步为淡水鱼；更进一步为草鱼。

36、优选地，一种口服制剂，包含本发明第一个方面的重组乳酸菌。

37、本发明的有益效果是：

38、本发明以乳酸菌作为活载体，表达hsp70蛋白，既能发挥乳酸菌的益生功能，又能发挥功能性蛋白(hsp70蛋白)在鱼类黏膜防御系统中关键调节作用，阻断小瓜虫感染，提高乳酸菌的抗小瓜虫感染的生态防病效果，在抗小瓜虫感染中取得了意料不到的技术效果，21天相对保护率高达90.48％。

39、同时，乳酸菌具有调节免疫功能，抑制肠道致病菌生长，维持肠道微生态平衡，合成多种维生素、氨基酸和酶，促进消化吸收，提供饲料利用率等功能，并且，乳酸菌的稳定性好，耐消化道的酸性环境，可以长时间在鱼体肠道驻留。

40、本发明以乳酸菌为载体，递送具有黏膜防御功能的草鱼hsp70蛋白，鱼体口服后，重组乳酸菌在鱼体肠道黏膜中固定和繁殖，展示表达的hsp70蛋白，直接作用鱼类黏膜防御系统发挥自身的活性功能，使鱼体获得抗小瓜虫感染能力。该重组乳酸菌具有小瓜虫感染阻断功能，与现有的技术比较，从宿主本源益生菌防控小瓜虫感染，在兼具功能性蛋白的生物活性，所以本发明改造后具有预防小瓜虫病的重组乳酸菌不同于现有的微生物生态防病技术。

技术特征：

1.一种重组乳酸菌，所述重组乳酸菌包含hsp70蛋白的编码基因，所述hsp70蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

2.根据权利要求1所述的重组乳酸菌，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的重组乳酸菌，其特征在于：

4.权利要求1或2所述的重组乳酸菌的制备方法，将所述hsp70蛋白的编码基因导入所述乳酸菌中。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

6.权利要求1～3任一项所述的重组乳酸菌在制备产品中的应用；所述产品具有c1)～c2)中至少一种功能：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

8.一种产品，包含权利要求1～3任一项所述的重组乳酸菌。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：

10.一种口服制剂，包含权利要求1～3任一项所述的重组乳酸菌。

技术总结
本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种表达HSP70的重组乳酸菌及其制备方法与应用。该重组乳酸菌以乳酸菌作为活载体，表达HSP70蛋白，既能发挥乳酸菌的益生功能，又能发挥功能性蛋白(HSP70蛋白)在鱼类黏膜防御系统中关键调节作用，阻断小瓜虫感染，提高乳酸菌的抗小瓜虫感染的生态防病效果。

技术研发人员：尹纪元,王庆,潘厚军,江孟臻,姜鹏,王浩,王英英,李莹莹,石存斌
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院珠江水产研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13