一种生产人血清淀粉样蛋白A1的基因工程菌及方法

本发明属于生物，具体涉及一种生产人血清淀粉样蛋白a1的基因工程菌及方法。

背景技术：

1、人血清淀粉样蛋白a(human serum amyloid a,saa)，是一种急性时相反应蛋白，其属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质。由104个氨基酸残基组成，它是一种小分子量蛋白。主要产生在肝细胞当中，但是在正常的组织细胞、动脉粥样硬化斑块中的细胞、脂肪细胞等中也都有产生。saa是一种主要的急性期反应物，在炎症期间，其在体内的浓度可以增加到正常水平的1000倍。细胞因子il-1β，il-6和肿瘤坏死因子-α在机体受到炎症、感染等刺激时，诱导saa的合成。目前已知在人体中存在的4种血清淀粉样蛋白a的基因分别为saa1-saa4，其中saa1和saa2是急性期的两种蛋白，并称为a-saa，两种蛋白之间存在7个氨基酸的差异；saa3是假基因，不翻译蛋白；最后一种saa4属于组成型蛋白质。

2、随着血常规(wbc)、c-反应蛋白(crp)、血清淀粉样蛋白a(saa)新三大常规的提出，saa作为新兴炎症标志物逐渐被医学界认可。目前主要通过胶体金法、酶联免疫法以及免疫散射比浊法等进行检测。现有技术文献中采用的大部分为胶体金法试剂盒，而临床中主要使用的是免疫散射比浊法自动化仪器。但是目前国产的成品检测试剂较少，并且价格昂贵，稳定性较差，因此急需高纯度无标签的saa蛋白，特别是有活性的蛋白，进行抗体的制备，进一步开发出高特异性的低成本的检测方法。同时由于近年来对于saa的研究日益增长，对于高质量无标签有活性的saa蛋白的需求也大幅增长。而目前的制备方法大多存在产量低、成本高且没有相关活性数据等缺陷。

技术实现思路

1、现有技术中适合工业化生产的原核表达系统制备无标签高活性的人血清淀粉样蛋白a1存在的问题包括：由于可溶表达量低等问题导致产量较低，同时生产出的蛋白纯化方法成本高且回收率低，不适合制备高活性的无标签人血清淀粉样蛋白a1。基于现有技术中存在的问题，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种生产人血清淀粉样蛋白a1的基因工程菌及方法。

2、本发明在蛋白n端融合了his-tag和凝血酶酶切位点，方便了下游无标签蛋白的纯化；特别地，本发明提供的工程菌表达制备saa1蛋白配套使用了镍磁珠纯化、肝素磁珠纯化等亲和纯化方法，使得获得的蛋白产量大，纯度高，成本低且蛋白活性好。

3、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

4、本发明首先提供一种生产人血清淀粉样蛋白a1的基因工程菌，其是在大肠杆菌(esherichia coli)中表达人血清淀粉样蛋白a1的基因的基因工程菌，所述的人血清淀粉样蛋白a1基因的n端带有表达多肽(his)n-lvprgs的基因，其中：4≤n≤8，且所述n为整数。

5、在本发明的一个实施方式中，所述的n较佳地为6。

6、在本发明的一个实施方式中，所述人血清淀粉样蛋白a1的氨基酸序列较佳地如seq id no.1所示。

7、较佳地，所述的人血清淀粉样蛋白a1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8、其中，根据本领域常识，所述的人血清淀粉样蛋白a1的基因和所述的表达多肽(his)n-lvprgs的基因可通过同源重组等方法整合到宿主大肠杆菌中进行表达，亦可通过表达载体将两者导入大肠杆菌中进行表达。

9、本发明中，优选使用携带含有所述人血清淀粉样蛋白a1基因的表达载体和所述表达多肽(his)n-lvprgs的基因的表达载体。较佳地，所述表达载体的骨架为质粒pet-28a(+)。

10、在本发明的一个实施方式中，本发明中所述的大肠杆菌较佳地为大肠杆菌bl21(de3)菌株。

11、本发明还提供一种包含人血清淀粉样蛋白a1基因的表达载体，所述人血清淀粉样蛋白a1基因的n端带有表达多肽(his)n-lvprgs的基因，其中：4≤n≤8，且所述n为整数。所述的n较佳地为6。

12、在本发明的一个实施方式中，所述的人血清淀粉样蛋白a1基因的核苷酸序列较佳地如序列表中seq id no.2所示。

13、在本发明的一个实施方式中，所述表达载体的骨架较佳地为质粒pet-28a(+)。

14、本发明还提供一种生产人血清淀粉样蛋白a1的方法，所述的方法包括以下步骤：

15、(1)将如上所述的生产人血清淀粉样蛋白a1的基因工程菌发酵；

16、(2)收集菌体、破碎离心得含有人血清淀粉样蛋白a1的上清，纯化即得。

17、为增加人血清淀粉样蛋白a1在发酵过程中的表达，较佳地，在步骤(1)中的发酵的过程中对所述的基因工程菌进行诱导表达。

18、步骤(2)中所述纯化可为本领域常规的纯化，为提高纯化效率和产量，所述的纯化较佳地为镍磁珠亲和纯化。

19、所述镍磁珠亲和纯化的方法可为本领域常规。较佳地包括下述步骤：

20、(2.1)溶液配制；所述的溶液可为平衡缓冲液(50mm tris-hcl,150mm nacl,ph8.0)，洗脱缓冲液1(50mm tris-hcl,150mm nacl,50mm imidazole,ph 8.0)，洗脱缓冲液2(50mm tris-hcl,150mm nacl,100mm imidazole,ph 8.0)，洗脱缓冲液3(50mm tris-hcl,150mm nacl,400mm imidazole,ph 8.0)，洗脱缓冲液4(50mm tris-hcl,150mm nacl,1mimidazole,ph 8.0)；

21、(2.2)磁珠预处理：镍磁珠悬浮液在离心管中充分混匀，磁性分离去除上清液，随后依次各用1倍磁珠体积的去离子水及平衡缓冲液洗涤磁珠，充分混匀磁珠，再用磁性分离去除上清液；

22、(2.3)上样：将超声破碎离心所得的上清加入装有已平衡的磁珠的离心管中，放置于旋转混合仪上，室温旋转孵育30min；

23、(2.4)洗脱：30min后，磁性分离并保留上清液以备后续检测，随后向离心管中依次加入1倍磁珠体积的洗脱缓冲液1-4，反复颠倒离心管使磁珠重悬，放置于旋转混合仪上，室温旋转孵育3min，磁性分离，取出洗脱液。

24、较佳地，所述的方法还包括步骤(3)：使用凝血酶酶切步骤(2)所得的带有his标签的人血清淀粉样蛋白a1，后除去溶液中的凝血酶；优选使用肝素磁珠除去溶液中的凝血酶。

25、本发明还提供一种利用如上所述的方法制备得到的人血清淀粉样蛋白a1。

26、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实施例。

27、本发明所用试剂和原料均市售可得。

28、与现有技术相比，本发明的优点及有益效果体现在以下方面：

29、利用本发明的基因工程菌制备人血清淀粉样蛋白a1蛋白时，大幅提高了人血清淀粉样蛋白a1的产量。进而选用了普通商品化的凝血酶去除标签的方法提高了无标签人血清淀粉样蛋白a1的产量，1l工程菌液中可获得20mg以上的蛋白；且获得的蛋白纯度高，几乎无杂蛋白存在，经sds-page灰度分析纯度＞98％；获得的无标签人血清淀粉样蛋白a1经过thp-1细胞活性实验、圆二色谱等证明其生理活性良好，可以作为各项机制研究的样品以及诊断试剂盒的原料试剂。由于融合了组氨酸标签，同时使用了镍磁珠以及肝素磁珠等纯化效率高的亲和纯化方法，大幅提高了无标签人血清淀粉样蛋白a1制备的得率。在一定程度上克服了人血清淀粉样蛋白a1表达量低而使得蛋白收率比较低的问题。由于使用本发明的基因工程菌产量高、纯化方法试剂消耗少等原因，使得生产成本大大降低，为大规模的工业化生产制备打下了基础。