一种可条件性释放并激活的细胞因子融合蛋白及其制备和用途的制作方法

本技术属于医药，具体涉及一种可条件性释放并激活的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途，更具体的，本技术涉及一种融合蛋白，一种核酸，一种表达载体，一种宿主细胞，一种制备融合蛋白的方法，一种融合蛋白复合体，一种免疫治疗细胞，一种药物组合物，以及融合蛋白或融合蛋白复合体在制备用于治疗或者预防癌症、传染病或自身免疫疾病的药物中的用途。

背景技术：

1、细胞因子在调节免疫应答方面扮演着重要作用，是肿瘤免疫治疗的基石。多种细胞因子(例如il-2，il-7，il-15等)具有显著的抗肿瘤作用，但半衰期短、靶向性差、全身给药易产生毒副作用等缺陷严重限制了其临床研发进展。目前已开发多种技术，包括fc融合、peg修饰、免疫细胞因子、细胞因子前药等，进行下一代细胞因子药物的研究，旨在提高细胞因子的成药性。其中，前体药物能够在正常组织对细胞因子的活性进行掩蔽，在到达肿瘤组织后，通过特异性蛋白酶酶解等方式恢复细胞因子的活性，从而达到靶向抗肿瘤的目标。前体药物在抗体药物领域已有大量研究，且有产品进入临床试验阶段，但在细胞因子领域的应用刚刚开始，是国内外研究的前沿。

2、已有报道的细胞因子前药，包括il-2、il-15、ifn-γ等，均采用具有亲和力的多肽或受体与细胞因子结合，如il-15采用il-15rβ/γ亚基结合，屏蔽其结合靶细胞上的il-15rβ/γ，从而掩蔽其功能。但这种亲和掩蔽的的方式存在潜在的药物开发障碍，例如具有亲和力的多肽或受体在肿瘤微环境被剪切后，游离状态下可能仍对细胞因子具有结合作用，影响细胞因子对靶细胞的识别及活性，进而影响抗肿瘤效果；此外，在前药分子中额外的亲和掩蔽多肽或受体会增加分子量、免疫原性及结构复杂性等，因此，目前的细胞因子前药亟需开发新的掩蔽技术。

3、免疫细胞因子是将单克隆抗体与细胞因子构建双功能融合蛋白，能够利用抗体的靶向性将细胞因子富集到肿瘤部位，提高细胞因子靶向性，并能够发挥抗体和细胞因子的协同抗肿瘤作用。基于临床前研究所表现出的显著的药效及良好的安全性，国内外制药公司均有在研产品进入临床研究。进展最快的分子为瑞士苏黎世大学和philogen公司联合研发的l19-tnf，与阿霉素联合用于治疗转移性软组织肉瘤已进入iii期临床研究。然而，研究发现，免疫细胞因子靶向到肿瘤的比例普遍低于0.1％，其副作用水平与所融合的细胞因子单药类似，导致目前临床试验阶段的免疫细胞因子药物的剂量局限于较低的水平，例如l19-tnf的iii期临床剂量仅有13ug/kg，远远低于一般单克隆抗体10-20mg/kg的剂量水平。因此，安全性依然是限制免疫细胞因子临床应用的主要瓶颈之一，对免疫细胞因子进行结构优化，进一步提高靶向性和安全性，是推动此类分子走向临床的关键。

技术实现思路

1、鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，本技术期望提供一种细胞因子融合蛋白，能够以空间位阻的方式对细胞因子活性进行掩蔽和调节，并能够与抗体类分子进一步融合，获得免疫细胞因子前药，以提高此类药物的治疗靶向性和治疗效果。

2、在本技术的一个方面，本技术提供了一种融合蛋白，包括第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元：所述第一结构单元包含下列的至少之一；其中，fc片段、抗体或其抗原结合片段；所述第二结构单元包含可裂解肽接头，所述可裂解肽接头能够被目的组织特异性酶切断裂；所述第三结构单元包含细胞因子或细胞因子与其受体的复合物；所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的n端或c端连接。第一结构单元的空间位阻能够对第三结构单元的结构进行掩蔽，从而调节第三结构单元与其靶细胞的结合，改变其活性。第二结构单元包含可裂解肽接头(在本文中又称可裂解连接子、可裂解的连接子)，可被目的组织(如肿瘤部位过表达的蛋白酶，可选为基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或天冬酰胺内肽酶)裂解。本文中公开的实验显示，本技术的融合蛋白在裂解前后第三结构单元显示出不同的活性，具有更好的靶向性和安全性。

3、在本技术的一些实施方式中，本技术的融合蛋白的第一结构单元通过第二结构单元连接于第三结构单元的n端。以第一结构单元包含fc片段、第三结构单元为细胞因子il-15与受体的活性复合物为例，融合蛋白的结构如图1a所示，从n端到c端依次包含抗体fc片段、可裂解的连接子、il-15和il-15rα的sushi结构域。本技术发现，与具有完全活性的fc-sushi-il-15超级激动剂蛋白相比(实施例中的lh02融合蛋白)，融合蛋白中il-15的促细胞增殖活性在第二结构单元裂解前明显更低，在裂解后活性大幅增强，在小鼠体内的安全性得到显著改善。

4、在本技术的一些实施方式中，本技术的融合蛋白的第一结构单元通过所述第二结构单元与第三结构单元的c端连接。以第一结构单元包含抗体fc片段第三结构单元为il-15与il-15rαsushi结构域的复合物为例，融合蛋白(命名为lic18)的结构如图1f所示，从n端到c端依次包含il-15rα的sushi结构域、il-15、含有可裂解连接子的第二结构单元和抗体fc片段。其中sushi结构域与il-15之间用柔性连接子连接。本技术发现，相比于sushi-il-15复合物位于fc的c端的融合蛋白，其位于fc的n端的融合蛋白在第二结构单元裂解前的活性明显更低，且在第二结构单元被酶切裂解后，活性大幅增强，靶向性和安全性得到显著改善。

5、在本技术的一些实施方式中，所述第一结构单元为抗体fab，其重链和轻链分别通过所述第二结构单元与第三结构单元的n端或c端连接。

6、在本技术的一些实施方式中，所述第一结构单元为抗体fab，其重链和轻链中的一条通过所述第二结构单元与第三结构单元的n端或c端连接。以第一结构单元为靶向pd-l1的单克隆抗体fab片段、第二结构单元为包含尿激酶底物的可裂解连接子、第三结构单元为细胞因子il-15与含有sushi结构域的il-15rα片段复合物为例，将第三结构单元通过第二结构单元融合于第一结构单元重链的c端，所获得的免疫细胞因子(命名为lic110)结构如图1c所示，其轻链为抗pd-l1单克隆抗体的轻链，其重链从n端到c端依次包含抗pd-l1抗体的重链可变区和ch1区、可裂解的连接子、il-15和含有sushi结构域的il-15rα片段。本技术发现，lic110融合蛋白fab的空间位阻对il-15的活性在酶切之前具有掩蔽作用，在酶切之后ilr部分被释放，从而空间位阻被解除，活性得到恢复。

7、在本技术的一些实施方式中，本技术融合蛋白的第三结构单元包含il-15及含有sushi结构域的il-15rα片段，其中sushi结构域为65-85个氨基酸长的片段，优选的为85个氨基酸的片段。二者通过柔性的柔性连接子连接，组成il-15超级激动剂(命名为ilr)，相较于单体il-15具有更好的体内稳定性和半衰期，在肿瘤部位对t细胞、nk细胞的激活能力更强，肿瘤治疗效果更好。

8、在本技术的另一方面，本技术了一种核酸，该核酸分子编码前述的融合蛋白。

9、在本技术的一些实施方式中，所述核酸分子为dna。

10、需要说明的是，对于本技术中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本技术中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本技术中的核酸序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

11、在本技术的另一方面，本技术提出了一种表达载体，其表达载体携带前述的核酸。在将上述核酸连接到载体上时，可以将核酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，该核酸与控制元件进行可操作地连接即可。

12、本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本技术的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的融合蛋白的表达，进而实现融合蛋白的体外大量获得。

13、在本技术的一些实施方式中，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体，优选地，所述表达载体为质粒表达载体。

14、在本技术的另一方面，本技术提出了一种重组细胞，其包括：携带前述的核酸或前述的表达载体；或，表达前述的融合蛋白。利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述的融合蛋白。

15、需要说明的是，本技术中所述的“适合条件”，是指适合本技术融合蛋白表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合融合蛋白表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的融合蛋白表达的条件。

16、在本技术的一些实施方式中，所述重组细胞是通过将前述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。

17、在本技术的一些实施方式中，所述重组细胞为真核细胞。

18、在本技术的一些实施方式中，所述重组细胞为哺乳动物细胞。

19、在本技术的另一个方面，本技术提供一种融合蛋白复合体，作为可选的方案，本技术的融合蛋白复合体为包含本技术融合蛋白的同源或异源二聚体蛋白质，复合体中各融合蛋白可通过fc区之间形成的链间键连接。

20、在本技术的另一个方面，本技术提供一种免疫细胞因子，其包括：前述的融合蛋白；所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段靶向肿瘤抗原或免疫检查点。

21、在本技术的一些实施方式中，所述靶向肿瘤抗原或免疫检查点包括egfr、vegf、claudin 18.2、nectin-4、gpc-3、pd-l1、pd-1、tigit、lag3、tim-3和ctla-4的至少之一。

22、在本技术的一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段来自人igg1或igg4抗体。

23、在本技术的一些实施方式中，以第三结构单元为细胞因子il-15与含有sushi结构域的il-15rα片段的复合物(如图1中ilr)为例，其n端可融合靶向pd-l1的单克隆抗体序列，所获得的免疫细胞因子(命名为lh05)结构如图1n所示，从n端到c端依次包含抗pd-l1抗体的fab段、fc片段、可裂解的连接子、il-15和含有sushi结构域的il-15rα片段。本技术发现，免疫细胞因子能够结合pd-l1抗原蛋白，且与具有完全活性的fc-sushi-il-15超级激动剂蛋白相比，免疫细胞因子中il-15的促细胞增殖活性在第二结构单元裂解前明显更低，在裂解后活性大幅增强，在小鼠体内的靶向性和安全性得到显著改善。

24、在本技术的另一个方面，本技术提供一种免疫治疗细胞，其表达前述的融合蛋白。由前可知，融合蛋白能够以空间位阻的方式对细胞因子活性进行掩蔽和调节，并能够与抗体类分子进一步融合，获得免疫细胞因子前药，以提高此类药物的治疗靶向性和治疗效果。由此，该免疫细胞可表达前述的融合蛋白，其可用于治疗传染病、癌症或自身免疫疾病。

25、在本技术的另一个方面，本技术提供一种药物组合物，其包括前述的融合蛋白、前述的核酸、前述的表达载体、前述的重组细胞、前述的融合蛋白复合体、前述的免疫治疗因子或前述的免疫治疗细胞。本技术的药物组合物可用于治疗传染病、癌症或自身免疫疾病。

26、在本技术的另一方面，本技术提供了一种联合药物或药盒，其包括：前述的融合蛋白或前述的融合蛋白复合体作为第一活性成分；靶向肿瘤的单克隆抗体作为第二活性成分。本技术融合蛋白与靶向肿瘤的单克隆抗体药物联用的技术方案，例如本技术的融合蛋白与抗vegf抗体或抗her2抗体联合，在小鼠肿瘤模型中，起到了协同的抗肿瘤药效作用。

27、在本技术的一些实施方式中，所述靶向肿瘤的单克隆抗体包括抗vegf抗体和/或抗her2抗体。

28、在本技术的另一些方面，本技术提供了一种前述的融合蛋白、融合蛋白复合物、免疫治疗细胞、药物组合物或联合药物或药盒在制备用于治疗传染病、癌症或自身免疫疾病的药物中的用途。