一种特异性检测重金属镉的基因工程菌株及其构建方法和应用

本发明属于基因工程菌，具体涉及一种特异性检测重金属镉的基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、镉是一种在自然环境中广泛存在的、非生物降解且非生物必需的重金属元素，具有高毒性、难降解、易残留等特点，并且具有致癌、致畸和致突变作用。镉及其化合物的用途非常广泛，主要用于充电电池、制造合金、染料生产、电镀工业等领域，是一类重要环境污染物。镉是一种积累富集型重毒金属元素，人类通过消化道和呼吸道摄取受镉污染的食物、水和空气，若镉摄入过量进入人体后，可引起肾、肺、肝脏、骨和生殖系统发生病变，严重的可致癌。随着工农业的发展，水体、土壤镉污染日趋加重，严重威胁人体健康，因此加强对重金属镉的检测十分必要。镉是水质检测的毒理指标，我国规定地下水、地表水、生活饮用水中镉含量限值均为0.005mg/l。

2、水质重金属检测技术可以分为物理、化学和生物学方法。物理、化学方法主要包括光谱检测技术(分光光度法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、x射线荧光光谱法)、电化学检测分析技术(示波极谱法、阳极溶出伏安法)和原子荧光光度检测技术，虽然检测精确度较高且反应灵敏，但是通常需要昂贵的仪器设备且耗时长。利用生物学方法来进行水质重金属毒性检测，尽管检测的灵敏度不及物理、化学方法高，但却能够直观地反映污染水体的综合毒性，是检测、控制化学物质污染的有效辅助手段，并因此在水质毒性检测中被广泛应用，发展迅速。根据受试对象的不同，生物学毒性检测方法可以分为动物实验、植物实验和微生物实验等。在各类生物学检测方法中，动物实验和植物实验可以灵敏而准确地反映水体毒性水平，但是这两种方法工作量大，测试时间长，不适于大批量水样的快速检测。而微生物，由于个体小，表面积大，对外界环境的输入响应灵敏，因而与其他方法相比，具有检测速度快、自动化程度高、人为错误少、灵敏度高、简便等优点。因其独特的生理特性，微生物中的发光细菌与光电传感技术相结合，广泛应用于水质生物毒性检测。

3、发光细菌是一类含有lux基因，在正常的生理条件下可发出波长在450～490nm范围内蓝绿色可见光的细菌，其通过自身携带的luxcdabe基因簇编码合成荧光素酶，可以与其相应的发光底物反应产生独特的光信号。发光细菌的发光是细菌体内正常生理氧化反应的结果，但其极易受到环境因素的影响(如温度)，所以任何干扰细菌呼吸或生理过程的因素都可以影响其发光效应。在水环境中，毒性物质的存在使发光细菌的活性下降，其与发光相关的代谢途径受阻，或直接影响与发光效应有关酶类的生物活性，短时间内发光细菌的发光强度就会减弱相关，且毒物的浓度和发光强度呈明显的负相关关系，这就是发光细菌法的基本原理。虽然发光细菌法具有快速、简便、费用低廉、灵敏度高等优点，但是其存在的缺点也不可忽视，例如对不同毒物的特异性差、培养条件苛刻导致发光不稳定、对不同检测环境的适应性差等。

4、在发光细菌的基础上，通过基因编辑技术研发出了重组发光细菌，即通过基因编辑技术将发光基因重组到对污染物敏感的受体细胞。imbi kurvet等将两种luxcdabe转化的大肠杆菌mc1061结构体pdnlux和psllux与费氏弧菌的发光性能进行了比较，研究了四种重金属(zn、cd、hg、cu)和三种有机物(苯胺、3,5-二氯苯胺和3,5-二氯苯酚)的毒性作用，结果表明重组发光大肠杆菌菌株可成功应用于各类有机化学品和重金属的毒性检测，并可在某些情况下(如温度较高时)替代费氏弧菌。但是重组发光大肠杆菌对重金属镉的检测限高于水质检测卫生标准，所以提高细菌对毒物的敏感性，降低其检测限是需要攻克的关键问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性检测重金属镉的基因工程菌株，通过插入pmerr-merr(m)-pmerr-luxcdabe表达元件，同时敲除cysj和cysi基因提高微生物对重金属镉的检测特异性和检测灵敏度。

2、本发明提供了一种特异性检测重金属镉的基因工程菌的构建方法，具有重复性好，操作简便的特点。

3、本发明还提供了一种特异性检测重金属镉的基因工程菌株在检测环境中镉的应用。

4、本发明提供了一种特异性检测重金属镉的基因工程菌株，以大肠杆菌菌株为基础菌株，包括以下改造：插入pmerr-merr(m)-pmerr-luxcdabe序列，敲除cysj和cysi基因。

5、优选的，启动子pmerr的核苷酸序列如seq id no:1所示；

6、调控基因merr(m)的核苷酸序列如seq id no:2所示；

7、发光基因luxc的核苷酸序列如seq id no:3所示；

8、发光基因luxd的核苷酸序列如seq id no:4所示；

9、发光基因luxa的核苷酸序列如seq id no:5所示；

10、发光基因luxb的核苷酸序列如seq id no:6所示；

11、发光基因luxe的核苷酸序列如seq id no:7所示；

12、插入片段pmerr-merr(m)-pmerr-luxcdabe的核苷酸序列如seq id no:8所示；

13、cysj基因的核苷酸序列如seq id no:9所示；

14、cysi基因的核苷酸序列如seq id no:10所示；

15、敲除片段δcysji的核苷酸序列如seq id no:11所示。

16、优选的，所述pmerr-merr(m)-pmerr-luxcdabe序列的插入位点为大肠杆菌菌株基因组中mbha基因位点。

17、优选的，所述大肠杆菌菌株包括e.coli k12 mg1655。

18、本发明提供了一种所述基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

19、向大肠杆菌菌株的基因组中分别插入双拷贝的启动子pmerr、调控基因merr(m)和发光基因luxcdabe序列，并敲除cysj和cysi基因；

20、所述调控基因merr(m)位于双拷贝启动子pmerr之间；

21、所述插入和敲除之间没有时间顺序的限制。

22、优选的，所述构建方法包括以下步骤：

23、1)敲除大肠杆菌菌株的基因组中mbha基因，插入双拷贝的启动子pmerr序列，得到第一工程菌株；

24、2)将调控基因merr(m)插入在所述第一工程菌株基因组中双拷贝的启动子pmerr序列之间，得到第二工程菌株；

25、3)将luxcd基因插入在所述第二工程菌株基因组中第二个拷贝启动子pmerr序列之后，得到第三工程菌株；

26、4)将luxab基因插入在所述第三工程菌株基因组中luxcd基因序列之后，得到第四工程菌株；

27、5)将luxe基因插入在所述第四工程菌株基因组中luxab基因序列之后，得到第五工程菌株；

28、6)敲除第五工程菌株基因组中的cysj和cysi基因，得到特异性检测重金属镉的基因工程菌。

29、优选的，步骤1)中所述敲除大肠杆菌菌株的基因组中mbha基因，插入双拷贝的启动子pmerr序列的方法，包括以下步骤：

30、采用pgrb-mbhaup/pgrb-mbhadown引物对退火得到的dna片段，与线性化pgrb质粒连接，构建得到pgrb-mbha；

31、用ppup/pp1down引物对pcr扩增得到片段pp1-1，用pp1up/ppdown引物对pcr扩增得到pp1-2，利用ppup/ppdown引物对进行重叠pcr扩增，得到双拷贝启动子pmerr重组整合序列；

32、将所述pgrb-mbha和双拷贝启动子pmerr重组整合序列共转染至含有predcas9质粒的大肠杆菌菌株感受态中，得到第一基因工程菌株e.coli-pmerr-pmerr；

33、步骤2)中所述调控基因merr(m)插入在所述第一工程菌株基因组中双拷贝的启动子pmerr序列之间的方法，包括以下步骤：

34、用ppup/ppdown引物对pcr扩增merr(m)基因，得到merr(m)基因重组整合片段；

35、pgrb-pp1up/pgrb-pp1down引物对经退火得到的dna片段与线性化pgrb质粒连接，构建得到pgrb-pp1；

36、将所述pgrb-pp1和merr(m)基因重组整合片段共转染至含有predcas9质粒的第一工程菌株感受态中，得到第二基因工程菌株e.coli-pmerr-merr(m)-pmerr；

37、步骤3)中所述luxcd基因插入在所述第二工程菌株基因组中第二个拷贝启动子pmerr序列之后的方法，包括以下步骤：

38、pgrb-pp2up/pgrb-pp2down引物对经退火得到dna片段，将所述dna片段与质粒pgrb线载连接，构建得到pgrb-pp2；

39、luxcdup/luxcddown引物对pcr扩增luxcd基因，得到luxcd基因重组整合片段；

40、将pgrb-pp2和luxcd基因重组整合片段共转染至含有predcas9质粒的第二工程菌株感受态中，得到第三基因工程菌株e.coli-pmerr-merr(m)-pmerr-luxcd；

41、步骤4)中所述luxab基因插入在所述第三工程菌株基因组中luxcd基因序列之后的方法，包括以下步骤：

42、pgrb-pp1up/pgrb-pp1down引物对经退火制得的dna片段与线性pgrb质粒连接，构建得到pgrb-pp1；

43、用luxabup/luxabdown引物对pcr扩增luxab基因，得到luxab基因重组整合片段；

44、将所述pgrb-pp1和luxab基因重组整合片段共转染至含有predcas9质粒的第三工程菌株感受态中，得到第四基因工程菌株e.coli-pmerr-merr(m)-pmerr-luxcdab；

45、步骤5)中所述luxe基因插入在所述第四工程菌株基因组中luxab基因序列之后的方法，包括以下步骤：

46、pgrb-pp2up和pgrb-pp2down退火制得的dna片段与线性化pgrb质粒连接，构建得到pgrb-pp2；

47、用luxeup/luxedown引物对pcr扩增luxe基因，得到luxe基因重组整合片段；

48、将所述pgrb-pp2和luxe基因重组整合片段共转染至含有predcas9质粒的第四工程菌株感受态中，得到第五基因工程菌株e.coli-pmerr-merr(m)-pmerr-luxcdabe；

49、步骤6)中所述敲除第五基因工程菌株的基因组中cysj和cysi基因的方法，包括以下步骤：

50、采用pgrb-cysjiup/pgrb-cysjidown引物对退火得到的dna片段，与线性化pgrb质粒连接，构建得到pgrb-cysji；

51、分别扩增cysj基因的上游同源臂和cysi基因的下游同源臂，经过重叠pcr扩增，得到cysji基因重组敲除片段；

52、将所述pgrb-cysji和cysji基因重组敲除片段共转染至含有predcas9质粒的第五基因工程菌株感受态中，得到第六基因工程菌株e.coli-pmerr-merr(m)-pmerr-luxcdabe-δcysji；

53、优选的，线性化pgrb质粒扩增用引物对为pgrb-lineup/pgrb-linedown；所述pgrb-lineup的核苷酸序列如seq id no:12；所述pgrb-linedown的核苷酸序列如seq idno:13；

54、所述pgrb-mbhaup/pgrb-mbhadown引物对的核苷酸序列如seq id no:14和seq idno:15所示；

55、所述ppup/pp1down引物对的核苷酸序列如seq id no:16和seq id no:17所示；

56、所述pp1up/ppdown引物对的核苷酸序列如seq id no:18和seq id no:19所示；

57、所述pgrb-pp1up/pgrb-pp1down引物对的核苷酸序列如seq id no:20和seq idno:21所示；

58、所述pgrb-pp2up/pgrb-pp2down引物对的核苷酸序列如seq id no:22和seq idno:23所示；

59、所述luxcdup/luxcddown引物对的核苷酸序列如seq id no:24和seq id no:25所示；

60、所述luxabup/luxabdown引物对的核苷酸序列如seq id no:26和seq id no:27所示；

61、所述luxeup/luxedown引物对的核苷酸序列如seq id no:28和seq id no:29所示；

62、所述pgrb-cysjiup/pgrb-cysjiown引物对的核苷酸序列如seq id no:30和seqid no:31所示；

63、扩增cysj基因的上游同源臂用引物对cysjup/cysjdown的核苷酸序列如seq idno:32和seq id no:33所示；

64、扩增cysi基因的下游同源臂用引物对cysiup/cysidown的核苷酸序列如seq idno:34和seq id no:35所示。

65、本发明提供了一种所述基因工程菌或所述构建方法得到的基因工程菌在检测环境中重金属镉的应用。

66、本发明提供了一种检测环境中重金属镉的试剂盒，包括所述基因工程菌和lb液体培养基。

67、本发明提供了一种特异性检测重金属镉的基因工程菌株，以大肠杆菌菌株为基础菌株，包括以下改造：插入pmerr-merr(m)-pmerr-luxcdabe序列，敲除cysj和cysi基因。本发明将镉响应调控基因merr(m)和发光基因luxcdabe整合到了大肠杆菌基因组上，构建了用于检测镉离子的稳定性、特异性和灵敏度高的基因工程菌。半胱氨酸可以通过脱硫作用将有毒的cd2+转化为cds沉淀，从而使细菌对重金属镉产生抗性。通过敲除镉抗性相关基因(cysj和cysi基因)可以减少半胱氨酸的形成，一定程度上能够提高细菌对重金属镉的敏感性。调控基因merr(m)具有重金属镉的选择性和识别性，在发光基因前添加镉调控基因，保证了只有镉离子存在使发光蛋白才会表达发荧光，从而保证检测体系对重金属镉的特异性。

68、同时本发明提供的基因工程菌株还具有以下有益效果：

69、(1)荧光本底值低、检测信号稳定：lux发光报告基因与其他经典报告子如绿色荧光蛋白(gfp)相比，荧光素酶的半衰期更短，允许快速连续重复测量。此外，因为报告元件位于宿主菌的基因组上，基因组为单拷贝，且lux基因在测量之前不需要激活，所以本发明的荧光本底值低且检测信号稳定。

70、(2)省时省力，检测效率高：本发明解决了物理、化学检测法的成本高、费时费力等缺点，以及发光细菌法的发光不稳定、环境适应性差等缺点，可以有效检测水质生物毒性。

71、(3)检测灵敏度高、特异度高：由于e.coli-pmerr-merr(m)-pmerr-luxcdabe-δcysji菌株是在野生型大肠杆菌的基础上敲除了cysj和cysi基因，可以减少半胱氨酸的形成，从而提高重金属镉的检测灵敏度。镉反应性抑制因子merr(m)起到转录抑制作用，在镉离子不存在时，转录调节因子与启动子结合阻遏基因表达，在镉离子存在时，转录调节因子从启动子上面脱离与其结合，启动子得以释放进而启动下游基因的表达。此外，位于基因组的检测元件随着传代而复制，不会因传代而丢失或拷贝量改变，故检测结果较为稳定。

72、(4)所述菌株中未导入任何外源抗生素抗性基因，属环境友好菌株，可以在水中重金属镉毒性检测方面得到应用。