抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA的筛选方法及其用途

本发明涉及遗传工程涉及的dna或rna领域，具体涉及抑制新型冠状病毒基因表达的shrna的筛选方法及其用途。

背景技术：

1、新型冠状病毒(sars-cov-2)隶属冠状病毒的β亚属，为单股正链的rna病毒，基因组约为30kb，由内部的遗传物质rna以及刺突蛋白(spike protein，s蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，e蛋白)、膜蛋白(membrane protein，m蛋白)和核衣壳蛋白(nucleoprotein，n蛋白)等构成。病毒里面是负责病毒繁殖的核酸物质rna，它由核衣壳蛋白包裹并保护着。在这四种蛋白中，最重要的就是刺突蛋白(s蛋白)，s蛋白是形成病毒“冠状”形态的主要蛋白之一，介导sars-cov-2进入细胞，是病毒感染宿主细胞的武器。sars-cov-2的遗传物质为rna，容易在复制过程中出错，大量复制可引起多种变异，导致该病毒存在较高的突变能力，一旦出现一种适应性好的变异株，则可能引起广泛传播。目前已经产生多种突变型，随着突变型的不断产生，其毒性和传播能力也不断改变。有研究显示德尔塔毒株相较于野生型的病毒载量提高了1000倍以上，这也增加了其转染能力提高的风险。越来越多的突变毒株产生多种多样的后果，包括传播加速和致病力改变等，导致早期研发的药物失效或治疗效果大大降低。因此，亟需进一步研究和开发更为安全、有效的靶向新型冠状病毒的临床治疗药物。

2、rna干扰(rna interference，rnai)技术是目前较为成熟的降低目的基因表达的方法之一。rnai是指外源双链rna(double-stranded rna，dsrna)在细胞内特异地诱导与之同源互补的mrna降解，使相应基因的表达沉寂关闭，从而引发转录后基因沉默(post-transcription gene silencing，ptgs)的现象。利用rnai技术可直接抑制病毒基因的表达和复制，从而抑制病毒的侵染。随着近几年基因测序和靶向运载技术的不断进步，rnai药物稳步发展，在抗病毒、抗肿瘤等领域具有巨大潜力。rnai药物可以对抗侵入病毒的作用，抑制其复制，减弱或消除其基因毒性，相比于单克隆抗体药物，rnai药物可真正实现基因层面的治本效果，此外rnai药物可以通过合成获得，生产和纯化更容易实现。短发夹rna(shorthairpin rna，shrna)是设计为能够形成发夹结构的非编码小rna分子，因其具有特殊的茎环结构，在哺乳动物细胞中可以长期甚至稳定地发挥rna干扰作用，而不引起非特异性反应。由于shrna序列较短和设计方便的特性，shrna介导的rna干扰技术能广泛的应用在不同的载体上递送到各种细胞中实现长期抑制目的基因表达的目的。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何安全、快速和/或低成本地筛选能有效抑制新型冠状病毒n、m和s基因表达的shrna。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了筛选抑制新型冠状病毒基因表达的shrna的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

3、a1)构建表达新型冠状病毒的n基因、m基因和部分s基因的动物模型；

4、a2)利用所述动物模型筛选待测shrna是否为抑制新型冠状病毒基因表达的shrna，所述待测shrna的靶点为所述n基因、所述m基因和所述部分s基因。

5、所述筛选抑制新型冠状病毒基因表达的shrna的方法可为鉴定或辅助鉴定抑制新型冠状病毒基因表达的shrna(即鉴定或辅助鉴定待测shrna干扰靶基因表达的效果)的方法。

6、所述待测shrna可为串联shrna，所述串联shrna包括分别针对n基因、m基因和部分s基因设计的shrna。

7、上述方法中，所述n基因的核苷酸序列可为seq id no.1的第1-669位，所述m基因的核苷酸序列可为seq id no.1的第670-1929位，所述部分s基因的核苷酸序列可为seq idno.1的第1930-2179位。

8、上述方法中，所述a1)可包括如下步骤：

9、b1)重组腺相关病毒aav-nms的构建：将所述n基因、所述m基因和所述部分s基因串联，得到名称为nms基因的dna分子，将所述nms基因克隆到腺相关病毒表达载体中，得到重组腺相关病毒表达载体，将所述重组腺相关病毒表达载体、辅助质粒和包装质粒共转染包装细胞，得到重组腺相关病毒aav-nms；

10、b2)动物模型的制备：用所述重组腺相关病毒aav-nms感染动物，得到表达新型冠状病毒n基因、m基因和部分s基因的动物模型。

11、进一步地，上述方法中，所述将n基因、m基因和部分s基因串联可以是将n基因、m基因和部分s基因直接连接，也可以是通过接头连接。

12、上述方法中，所述nms基因的核苷酸序列可为seq id no.1。

13、进一步地，上述方法中，所述辅助质粒可为phelper。

14、进一步地，上述方法中，所述包装质粒可为prep2capx。

15、进一步地，上述方法中，所述包装细胞可为人胚肾细胞hek293。

16、进一步地，上述方法中，所述动物可为小鼠。

17、进一步地，所述小鼠可为3-5周龄小鼠。

18、进一步地，上述方法中，b2)中所述感染动物(小鼠)的方法可为滴鼻方法。

19、进一步地，所述滴鼻方法中，所述重组腺相关病毒aav-nms浓度为4×1012g/ml，滴鼻的量为100μl/只。

20、本发明还提供了上述方法所构建的表达新型冠状病毒n基因、m基因和部分s基因的动物模型的下述任一种应用：

21、e1)在筛选抑制新型冠状病毒基因的shrna中的应用；

22、e2)在筛选治疗新型冠状病毒感染引起的疾病(如新型冠状病毒感染)的rna干扰类药物中的应用；

23、e3)在筛选治疗新型冠状病毒感染引起的疾病的能用于动物实验和临床实验的aav制剂中的应用。

24、上述方法中，所述a2)可包括如下步骤：

25、c1)将表达所述待测shrna的dna分子克隆到腺相关病毒表达载体中，得到重组腺相关病毒表达载体，将所述重组腺相关病毒表达载体、辅助质粒和包装质粒共转染包装细胞，得到重组腺相关病毒scaav-shrna；

26、c2)用所述重组腺相关病毒scaav-shrna感染所述动物模型；

27、c3)检测所述动物模型中所述n基因、所述m基因和/或所述部分s基因的表达水平，根据所述表达水平筛选抑制新型冠状病毒基因表达的shrna。

28、所述抑制新型冠状病毒基因表达的shrna为或候选为抑制所述n基因、所述m基因和所述部分s基因表达的待测shrna。

29、进一步地，上述方法中，所述辅助质粒可为phelper。

30、进一步地，上述方法中，所述包装质粒可为prep2capx。

31、进一步地，上述方法中，所述包装细胞可为人胚肾细胞hek293。

32、进一步地，上述方法中，所述动物模型可为小鼠模型。

33、所述腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)可为自身互补腺相关病毒(scaav)。

34、所述重组腺相关病毒scaav-shrna中，shrna的启动子可为u6启动子。

35、每个完整的shrna表达单元都包含一个u6启动子和终止子。

36、进一步地，上述方法中，c2)中所述感染所述动物模型(小鼠模型)的方法可为滴鼻方法。

37、进一步地，所述滴鼻方法中，所述重组腺相关病毒scaav-shrna浓度为4×1012g/ml，滴鼻的量为100μl/只。

38、进一步地，所述小鼠模型可为表达新冠病毒nms基因(seq id no.1)的小鼠模型并且构建4周。

39、本发明还提供了重组腺相关病毒在筛选或鉴定抑制新型冠状病毒基因表达的shrna中的应用、在制备筛选或鉴定抑制新型冠状病毒基因表达的shrna的产品中的应用或在制备抑制新型冠状病毒感染的药物中的应用，所述重组腺相关病毒可为所述重组腺相关病毒aav-nms，或所述重组腺相关病毒aav-nms也在本发明的保护范围内。

40、进一步地，所述新型冠状病毒基因可为新型冠状病毒n基因、m基因和部分s基因。

41、进一步地，所述重组腺相关病毒aav-nms携带n基因、m基因和部分s基因的串联基因(nms基因)，表达n、m和部分s基因。

42、本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

43、m1)抑制n基因、m基因和部分s基因表达的sirna和/或shrna；

44、m2)核苷酸序列为seq id no.24、seq id no.30和/或seq id no.40的sirna；

45、m3)核苷酸序列为seq id no.44、seq id no.45和/或seq id no.46的shrna；

46、m4)核苷酸序列为seq id no.43的第394-440位、seq id no.43的第723-769位和/或seq id no.43的第1052-1099位的dna分子；

47、m5)含有核苷酸序列为seq id no.43的第394-440位、seq id no.43的第723-769位和/或seq id no.43的第1052-1099位的dna分子的重组载体；

48、m6)含有m5)所述重组载体的重组微生物；

49、m7)含有m5)所述重组载体的重组细胞。

50、核苷酸序列为seq id no.43的第394-440位所示的dna分子编码shm-3(seq idno.45)，核苷酸序列为seq id no.43的第723-769位所示的dna分子编码shn-7(seq idno.44)，核苷酸序列为seq id no.43的第1052-1099位所示的dna分子编码shs(seq idno.46)。

51、进一步地，m5)中所述重组载体可为重组腺相关病毒表达载体pgoi-shnms，所述pgoi-shnms的核苷酸序列为seq id no.43。

52、其中seq id no.43的第723-769位为shn-7的编码dna序列，用于抑制n基因的表达，其干扰的靶序列为seq id no.25。

53、seq id no.43的第394-440位为shm-3的编码dna序列，用于抑制m基因的表达，其干扰的靶序列为seq id no.31。

54、seq id no.43的第1052-1099位为shs的编码dna序列，用于抑制s基因的表达，其干扰的靶序列为seq id no.41。

55、核苷酸序列为seq id no.24的sirna为sin-7，其干扰的靶序列为caacaaggccaaactgtca(seq id no.25)，用于抑制n基因的表达。

56、核苷酸序列为seq id no.30的sirna为sim-3，其干扰的靶序列为ggacctgcctaaagaaatc(seq id no.31)，用于抑制m基因的表达。

57、核苷酸序列为seq id no.40的sirna为sis，其干扰的靶序列为ctagtctctagtcagtgtgtt(seq id no.41)，用于抑制s基因的表达。

58、核苷酸序列为seq id no.44的shrna为shn-7，其编码dna序列为seq id no.43的第723-769位。

59、核苷酸序列为seq id no.45的shrna为shm-3，其编码dna序列为seq id no.43的第394-440位。

60、核苷酸序列为seq id no.46的shrna为shs，其编码dna序列为seq id no.43的第1052-1099位。

61、所述shrna和/或sirna用于沉默或抑制新型冠状病毒n基因、m基因和部分s基因的表达。

62、所述shrna和/或sirna可为利用本发明所述筛选方法筛选得到。

63、本发明还提供了所述生物材料的下述任一种应用：

64、d1)在抑制新型冠状病毒n基因、m基因和s基因表达中的应用；

65、d2)在制备预防或治疗新型冠状病毒感染引起的疾病的药物中的应用；

66、d3)在制备抑制新型冠状病毒活性的药物中的应用；

67、d4)在制备抑制新型冠状病毒感染的药物中的应用。

68、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为goi质粒、包装质粒prep2capx和/或辅助质粒phelper。

69、本文所述微生物可为酵母、细菌、藻、真菌或病毒。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia)，欧文氏菌(erwinia)，根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium)，产碱菌属(alcaligenes)，假单胞菌属(pseudomonas)，芽孢杆菌属(bacillus)等。具体可为腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)，所述腺相关病毒可为自身互补腺相关病毒(scaav)。

70、所述重组微生物具体可为重组腺相关病毒scaav-shrna。所述重组腺相关病毒scaav-shrna含有核苷酸序列为seq id no.43的重组腺相关病毒表达载体pgoi-shnms，用于沉默或抑制新型冠状病毒n基因、m基因和部分s基因的表达。

71、本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物含有本文m1)、m2)和/或m3)中所述sirna和/或shrna和/或m5)中所述重组载体。

72、进一步地，所述重组载体可为重组腺相关病毒表达载体pgoi-shnms，所述pgoi-shnms的核苷酸序列为seq id no.43。

73、进一步地，所述药物组合物还含有一种或者是多种药学上可接受的载体。

74、所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

75、本发明还提供了构建表达新型冠状病毒的n基因、m基因和部分s基因的动物模型的方法，所述方法包括本文所述的a1)。

76、进一步地，所述药物或药物组合物用于改善、预防或治疗新型冠状病毒感染引起的疾病和/或用于抑制新型冠状病毒感染。

77、所述药物可为小核酸药物或小核酸制剂或rna干扰类药物(rnai药物)。

78、进一步地，所述新型冠状病毒感染引起的疾病可为呼吸系统感染和/或消化系统感染。

79、进一步地，所述呼吸系统感染可为呼吸道感染和/或肺部感染，所述呼吸道感染可为鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，所述肺部感染可为新型冠状病毒感染。所述消化系统感染可为肝炎和/或腹泻。

80、本文所述新型冠状病毒(sars-cov-2)n、m和部分s基因为可介导sars-cov-2病毒感染宿主细胞的关键基因，抑制n、m和s基因的表达可抑制病毒的复制，减弱或消除其基因毒性，从而抑制病毒的侵染。

81、小鼠是潜在的动物模型，通过构建表达新冠病毒等病毒中的重要基因的小鼠作为rna干扰类药物筛选的动物模型，减少新冠病毒感染小鼠的使用，既加快了药物筛查的速度、减少了相应的成本，又减少了动物实验中病毒外泄的风险。实现病毒基因表达造模-shrna的治疗模型或shrna-目的基因的预防模型。通过设计目的病毒的较为重要的基因和相应的shrna可应用于其它的病毒疾病，例如流感病毒，家禽家畜以及宠物的相关病毒疾病。本领域技术人员可通过本发明所述筛选方法将介导其他病毒或病原微生物感染宿主细胞的关键蛋白的基因进行串联、构建病毒基因表达动物模型，来筛选能有效抑制病毒基因表达的shrna。这些替代方法未脱离本发明的范围，本发明应包括这些替代方法。

82、利用本发明所述筛选方法筛选得到的shrna可进一步开发为用于动物实验和临床实验的aav制剂。进一步地，所述aav制剂包括本发明所述重组腺相关病毒scaav-shrna。

83、本发明公开了一种筛选靶向(抑制)新型冠状病毒n基因、m基因和s基因的shrna的方法和能有效抑制上述基因表达的shrna。本发明首先将新型冠状病毒(简称新冠病毒)的n基因、m基因和部分s基因串联，并获得重组腺相关病毒aav-nms；通过小鼠滴鼻方法，3-4周后，获得肺部及肝脏等组织高表达新冠病毒n基因、m基因和部分s基因的小鼠模型。随后构建靶向新冠病毒n基因、m基因和s基因的串联shrna，并获得重组腺相关病毒aav-shrna，在已建立的病毒基因表达动物模型上，通过滴鼻方法使用重组腺相关病毒aav-shrna，可有效抑制新冠病毒n基因、m基因和部分s基因的rna表达量。本发明不仅提供了一种安全、快速低成本的靶向新冠病毒的小核酸药物的筛选方法，还提供了可用于新冠病毒感染治疗的小核酸制剂。

84、与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

85、1、本发明能较快的建立新型冠状病毒的目的基因表达的模型，用于筛选治疗新型冠状病毒感染的rna干扰类药物，同时避免了用新冠感染的动物进行小核酸药物筛选的风险。

86、2、本发明能利用新型冠状病毒的目的基因表达的动物模型较快筛选治疗新型冠状病毒感染的rna干扰类药物和测试能用于动物实验和临床实验的aav制剂。

87、3、本发明还可作为病毒基因rna表达造模-shrna的治疗模型或预防性模型，除新冠病毒外还可以应用到流感病毒、家禽家畜以及宠物上的病毒防治上。