一种基于单细胞全基因组扩增的PKD1变异分子检测方法和应用

本发明属于胚胎植入前遗传检测领域，具体涉及一种基于单细胞全基因组扩增的pkd1变异分子检测方法和应用。

背景技术：

1、在二代测序的技术中，针对有其他高度同源区域的基因如pkd1等基因往往无法明确变异本身所在的位置是否在目标的基因区域或是在非目标的同源区/假基因区域。虽然这些基因上有一些snp的存在，可能可以通过参考基因序列来比对到各自的特定区域，但是由于二代测序会将基因组dna随机打断片段，而导致被打断的片段在测序过程中可能会因特异性snp的不均匀测序结果而导致后续的生信分析流程中因为原始数据中的频率过低无法明确区分目标变异的实际所在区间。

2、以pkd1基因为例，该基因在16号染色体上，并有6个高度同源的假基因(pkd1p1、pkd1p2、pkd1p3、pkd1p4、pkd1p5、pkd1p6)(编码区同源性约为97.49％-98.81％)，在一般的二代测序结果出来后，需要采用长链聚合酶连锁反应(long-range pcr)的方法来扩增出pkd1包含低频人群变异位点后，才能针对此长片段聚合酶产物进行sanger测序或二代测序的合并方法才可能明确这类变异的存在。

3、在2021年，北京大学第三医院[a comprehensive pgt-m strategy for adpkdpatients with de novo pkd1mutations using affected embryo or gametes asproband.wang,y et.al.journal of assisted reproduction and genetics.03may2021]及郑州大学附属第一医院[anovel monogenic preimplantation genetic testingstrategy for sporadic polycystic kidney caused by de novo pkd1mutationrunning title:a novel pgt-m strategy for adpkd.shi,h.et.al.clingenet.2021feb；99(2):250-258]的团队利用少量胚胎细胞进行全基因组扩增后，通过long-range pcr方法进行sanger测序，再结合二代测序(ngs)所提供的多态情况(snp)来决定变异是否位于特定的单倍体后，作为执行单基因/单基因疾病的植入前基因检测(pgt-m)的策略，以筛选出健康的胚胎植入宫内，使患者能生育出不携带pkd1(疑似)致病变异的子女。

4、上述策略都需要采用long-range pcr结合sanger测序的方法来进行胚胎是否携带(疑似)致病变异的判定，然而pkd1基因的结构相当复杂，且其基因序列中的gc含量高达70-80％，因此增加long-range pcr的执行难度。另外，利用胚胎细胞来扩增其全基因组dna无法确保每一个胚胎的扩增产物片段都能产生足长的dna扩增片段作为后续long-rangepcr的模版(template)，这是因为一般受精卵在体外形成后，仅能体外培养5-6天(囊胚)，从囊胚滋养外胚层中活检3-8个细胞用于遗传学检测，所以能用来提取基因组dna的细胞数相当稀少，无法保证在裂解以及扩增的过程中出现基因组dna的部分断裂情况，一旦基因组断裂的部分在致病位点附近，就可能无法在扩增的过程中获取适合long-range pcr长度或序列区间的template，因而提高long-range pcr的失败率，无法采用原有的策略来解决患者生育健康子女的问题。

5、上述郑州大学的文献中，提及其所使用的39个胚胎有2个胚胎的扩增产物无法成功取得long-range pcr产物，而在实际使用的过程中，胚胎的父亲也是通过long-range-pcr合并sanger的方式进行分子诊断，但当同样的引物来操作胚胎细胞的基因组扩增产物时，10个胚胎的基因组扩增产物均无法获得long-range pcr产物，说明原有的方法可能有极高的失败概率，急需开发一种新的检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述不足，本发明的主要目的是提出一种基于单细胞全基因组扩增的pkd1变异分子检测方法，利用单精子、胚胎或极体的基因组dna扩增产物来验证(疑似)致病变异的存在与否及与该(疑似)致病变异连锁的单倍体型，无需采用失败率较高的long-range pcr方法也能获得健康的胚胎。

2、本发明的另一目的是提出上述基于单细胞全基因组扩增的pkd1变异分子检测方法在非诊断目的的分子生物学检测中的应用。

3、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

4、本发明提供一种非诊断目的的基于单细胞全基因组扩增的pkd1变异分子检测方法，其基于受试者男方单精子或者夫妻双方体外受精后的生殖细胞或胚胎细胞作为检测对象，包括以下步骤：

5、s1：提取受试者男方单精子或者夫妻双方体外受精后的生殖细胞或胚胎细胞作为待测细胞，进行全基因组dna扩增，得到全基因组dna扩增产物；

6、s2：查找pkd1基因变异位点和其假基因位点信息并设计引物；

7、s3：针对所述全基因组dna扩增产物中长度为150-250bp的短片段进行扩增并进行深度靶向二代测序区分pkd1和假基因的reads，获得pkd1变异位点信息；

8、s4：采用全基因组snp芯片或二代测序对所述全基因组dna扩增产物进行检测，得到全基因组snp信息，其包含pkd1基因和其上下游2mb内的snp信息，从而进行基因组拷贝数变异分析；

9、s5：同时结合突变信息和snp信息进行snp基因型分型，然后进行家系单体型连锁分析，判断受试者夫妻双方体外受精后的胚胎是否携带家系中pkd1突变所在的单体型。

10、作为优选，步骤s1中，所述待测细胞为体外受精后培养的囊胚滋养层活检细胞3-8个或者极体或者单精子。

11、作为优选，步骤s2中，所述pkd1基因为人类可特异扩增pkd1基因，所述引物包括上、下游序列分别如seq id no:1—30所示的引物对，其设计原则是尽量与假基因干扰区域相区分，用于靶向扩增pkd1的变异位点及其上下游500bp内的区域。

12、作为优选，步骤s5中，所述snp基因型检测的方法包括：步骤s2中所述全基因组dna扩增产物获得的样本按照家系分组，步骤s3中所述靶向二代测序检测为阳性的样本作为先证者参照，分别与受试者夫妻双方的全基因组扩增样本编组，结合所述全基因组snp芯片或二代测序获得的snps信息，进行snp基因型分型，构建胚胎分子核型和家系单体型，以此分别鉴定胚胎基因组拷贝数变异状况和鉴别胚胎基因变异携带状态。

13、作为更优选，步骤s5中，所述单体型分析的方法包括：基因变异携带者为杂合型，其配偶为野生型，并且在靶向二代测序检测参照样本为携带者杂合型的snp位点，从变异点上下游2mb内选择覆盖基因变异点区域的信息snps，且染色体每mb内至少选择1个信息snp，由此确定的信息snps位点通过家系连锁分析，得到覆盖基因变异区域整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合为家系单体型。

14、本发明还提供一种胚胎植入前的检测产品，其特征在于，包括上、下游序列分别如seq id no:1—30所示的引物对。

15、作为优选，所述检测产品为检测试剂盒。

16、本发明还提供所述非诊断目的的基于单细胞全基因组扩增的pkd1变异分子检测方法在基因组dna总量未达测序浓度或dna连续片段长度在500bp以下的待测细胞分子生物学检测中的应用，其中所述待测细胞为胚胎植入前受试者男方单精子、或者夫妻双方体外受精后的生殖细胞或胚胎细胞。

17、当待测细胞的基因组dna总量未达测序浓度或质量偏低时(dna连续片段降解到500bp以下)，无法采用long-range pcr合并sanger测序的方法来明确特定低频位点是否位于pkd1基因上或是与pkd1基因高度同源的6个假基因，本发明通过短片段pcr特殊设计、深度靶向测序技术和多重参考序列的联合数据分析三种技术合并应用，可以将pkd1基因与其6个高度同源的假基因的低人群频变异(数据库未有记录或少于万分之一的变异)有效区分出来，并进行变异位置评估。

18、传统采用long-range-pcr合并sanger测序的方法对于基因组dna扩增产物的质量要求较高，且容易导致失败率提高。本发明针对在基因组内有假基因或同源区序列干扰诊断的单基因疾病患者，尤其是携带(疑似)致病变异为夫妻新发变异或无法取得其父母基因信息且未生育过患儿或缺乏先证者样本(特别是容易因为假基因干扰诊断的基因变异)的患者，通过患者单精子、极体或者体外授精后的胚胎活检细胞进行单细胞或少量细胞扩增并行深度靶向二代测序检测(但无需先产生区别pkd1与其假基因间的pcr产物)，利用患者及其配偶、男方单精子或者体外授精后的生殖细胞或胚胎细胞(深度靶向二代测序检出为变异携带或不携带样本)进行家系单体型连锁分析，能快速、简便、准确地区分出单基因疾病变异的胚胎和野生型正常的胚胎，并同时对胚胎的染色体拷贝数变异进行筛查，提高临床妊娠率，实现在胚胎移植前及时阻断单基因疾病向下一代的遗传传递。

19、另外，由于采用短片段pcr靶向富集(疑似)致病位点信号联合深度靶向测序结合体细胞突变分析法可区分出携带(疑似)致病变异与未携带(疑似)致病变异的生殖细胞或胚胎细胞，并针对这些细胞进行结合snp芯片分析找出各自的单倍体型，进一步分析所有待测胚胎(疑似)致病变异是否与特定单倍体型有高度关联性，从而得出未携带致病变异的单倍体型有利于挑选健康胚胎进行植入。

20、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

21、1、本发明基于单细胞全基因组扩增的分子生物学检测作为胚胎植入前检测用于遗传诊断和人类辅助生殖，只需要胚胎、精子或极体的基因组dna扩增产物短片段(～200bp)存在即可进行检测，验证(疑似)致病变异的存在与否及结合snp家系连锁得到该(疑似)致病变异连锁的单倍体型，从而降低挑选胚胎的难度并进一步提高挑选出针对adpkd患者生育出健康子女的机率。

22、2、本发明中单细胞全基因组扩增的短片段长度为150-250bp，其pcr经济及时间的成本要求较低，一般仅需1小时即可完成富集，而long-range pcr经济及成本较高，操作一轮的时间至少需4-8小时。另外，短片段pcr不易受dna质量或二级结构的影响，成功率较高；而long-range pcr易受dna质量或二级结构的影响，失败率较高。

23、3、本发明利用snp芯片分析单倍体型的成本较传统上以二代测序提供单倍体型的时间及经济成本相比较低。

24、4、本发明利用富集的短片段pcr产物进行深度靶向二代测序并结合体细胞变异分析，利用比对参考序列将专属pkd1的reads和假基因上的reads直接区别开来，传统上的sanger分析无法直接将pkd1与假基因的同源区做直接区分，因此被迫使用失败率较高的long-range pcr产物来测序。

25、5、本发明的检测技术可直接对胚胎细胞扩增产物为基础来执行，操作步骤较原有的方法容易。