用于同时检测9种磺胺药物的混合广谱核酸适配体

本发明具体涉及一种用于同时检测9种磺胺药物的混合广谱核酸适配体及其应用。

背景技术：

1、磺胺类药物因为价格低廉且具有广谱抗菌作用可以很好地预防治疗动物感染疾病，被广泛应用于畜牧和水产养殖。然而，违规或超标使用磺胺类抗生素而导致畜禽肉类和海产品中磺胺类药物残留超标的事件时有发生，给消费者的人体健康带来极大的安全隐患。因此，加强对动物源性食品包括海产品中磺胺类药物残留的筛查和检测，对于保证畜禽肉类和海产品的安全消费具有重要意义。

2、磺胺类药物种类繁多，目前常见的磺胺类药物有19种。为了避免产生抗药性，在畜牧和水产养殖中，19种常用的磺胺类药物通常被轮换使用。所以在对动物源性食品包括水产品中的磺胺类药物残留进行筛查检测时，需要同时把多种常用的磺胺类药物或整组常用磺胺类药物同时进行检测，才能准确筛查判别出动物源性食品包括水产品中是否存在磺胺类药物残留超标的情况。

3、目前，用于同时检测多种磺胺类抗生素的主要方法包括色谱方法、色谱-质谱联用方法和免疫分析方法。色谱和色谱-质谱联用等仪器方法虽然可以同时检测多种磺胺类抗生素、且准确度高，但是其需要昂贵的仪器和复杂耗时的样品前处理，无法用于畜禽肉类和海产品中磺胺类抗生素残留的现场快速筛查。免疫分析方法包括酶联免疫（elisa）方法具有快速、便捷和无需复杂仪器等优点，已被开发用于多种磺胺类抗生素的同时快速检测。但是，免疫分析方法是利用抗体作为识别探针，这使其存在抗体制备成本高、制备周期长、热稳定性差、不易保存和检测成本高等缺点，也无法满足畜禽肉类和海产品中磺胺类抗生素残留现场快速筛查的需求。

4、核酸适配体不但具有和抗体相似甚至更好的特异性和亲和力，而且可以通过人工体外筛选和化学合成进行制备，具有成本低、稳定性好、易保存等优点，已经被尝试用于构建磺胺类药物的快速检测方法。但是目前已有的基于核酸适配体检测磺胺类抗生素的方法基本上只能检测单一种的磺胺类药物，无法同时检测多种磺胺类药物，因而无法满足畜禽肉类和海产品中磺胺类抗生素残留现场快速筛查的需求。现有专利zl 202110701824.1中筛查了3条对10种常用磺胺类抗生素（磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺索嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶）有一定亲和力的广谱特异性核酸适配体序列，并建立了可同时检测5种磺胺类药物（磺胺喹恶啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺索嘧啶）的快速比色检测方法。但是，由于所获得的广谱特异性核酸适配体序列对靶标磺胺类药物结合力较低，所以所建立的可同时检测5种磺胺类药物的比色检测方法灵敏度低（可视化检测限2.0-5.0µm）、且存在较明显的恩诺沙星干扰，也难以满足畜禽肉类和海产品中磺胺类抗生素残留现场快速筛查的需求。因此，筛选出对多种常用磺胺类药物具有更高结合力和更好特异性的广谱特异性核酸适配体，并建立灵敏度高、选择性和稳定性好、可同时快速检测多种磺胺类药物的检测方法具有重要意义。

技术实现思路

1、针对目前已有的基于核酸适配体的磺胺类药物检测方法存在的检测种类少、或多种检测时灵敏度低和存在恩诺沙星干扰的问题，本发明提供了一种用于同时检测9种磺胺药物的混合广谱核酸适配体及其应用，其利用2条能同时高特异性、高结合力识别多种磺胺类药物的核酸适配体（sul-01和sul-04）混合作为识别探针，建立了一种可同时快速检测水环境和海产品中9种磺胺类药物残留的比率型荧光方法，为水环境和海产品中磺胺类药物残留的快速、低成本、高灵敏筛查和检测提供技术支撑。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于同时检测9种磺胺药物的混合广谱核酸适配体，其是由核酸适配体sul-01与sul-04构成；

4、所述核酸适配体的核苷酸序列如下：

5、sul-01： 5’-cttacgaccaaggctaggcttgccgaggggaggtgtggtgttagggtcgtaag-3’；

6、sul-04：

7、5’-cttacgaccgggtcaaggctgaggtgggtgacgtacggacaaggtcgtaag-3’。

8、所述混合广谱核酸适配体可用于构建同时检测9种磺胺药物的比率型荧光方法。其具体构建步骤如下：

9、1）先在核酸适配体sul-01与sul-04的3’端修饰6-羧基荧光素（fam）、5’端修饰琥珀酰亚胺酯（ned）荧光染料，获得ned-sul-01-fam和ned-sul-04-fam；

10、2）将所得ned-sul-01-fam和ned-sul-04-fam分别与标记有荧光猝灭基团bhq2的cdna链于结合缓冲溶液中混合，并于95℃退火5分钟，形成含ned-sul-01-fam/cdna共轭体的溶液和含ned-sul-04-fam/cdna共轭体的溶液；

11、3）将所得含ned-sul-01-fam/cdna共轭体的溶液和含ned-sul-04-fam/cdna共轭体的溶液等体积混合均匀，并加入磺胺药物标准溶液或待检测的样品溶液，室温下放置孵育1小时后，使用酶标仪以480 nm激发波长测定500-600 nm波长范围内的荧光光谱，并记录波长525 nm和580 nm的荧光信号f525、f580；

12、4）利用磺胺药物标准溶液的浓度与荧光信号的比值f580/f525建立线性关系曲线，再依据所得线性关系曲线及样品溶液的荧光信号比值f580/f525计算获得样品中磺胺药物的浓度。

13、进一步地，所述cdna链的序列为5’-cggtcgtaag-bhq2-3’。

14、进一步地，修饰后所得ned-sul-01-fam或ned-sul-04-fam与cdna链混合的均摩尔比为1:4。

15、进一步地，所述结合缓冲溶液中含20 mm tris-hcl、300 mm nacl、5 mm mgcl2、0.1vol% tween 20，其ph=7.4。

16、进一步地，ned-sul-01-fam/cdna共轭体与ned-sul-04-fam/cdna共轭体混合的摩尔比为1:1。

17、进一步地，所述磺胺药物为磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺喹噁啉、磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺眯、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺嘧啶。

18、本发明的显著优点在于：

19、（1）本发明通过筛查获得2条可同时特异性识别多种磺胺类药物的核酸适配体序列（sul-01和sul-04），其中，sul-01对磺胺-5甲氧嘧啶（smd）、磺胺喹噁啉（sq）、磺胺间甲氧嘧啶（smm）、磺胺甲基嘧啶（smr）和磺胺二甲基嘧啶（smz）等5种磺胺类药物有强的特异结合力，对磺胺吡啶（spd）和磺胺嘧啶（sd）等2种磺胺类药物有一定的特异结合力；sul-04对磺胺吡啶（spd）、磺胺噻唑（st）、磺胺间甲氧嘧啶（smm）、磺胺眯（sgn）和磺胺甲基嘧啶（smr）等5种磺胺类药物有强的特异结合力，对磺胺嘧啶（sd）和磺胺甲氧哒嗪（smp）等2种磺胺类药物有一定的特异结合力；且sul-01和sul-04对硫酸卡那霉素（kana）、四环素（tc）、恩诺沙星（(enr）、头孢噻肟（ctx）、苯唑西林（oxcl）和氨苄西林（amp）等6种其他常用抗生素没有结合力（如图2）。利用sul-01和sul-04制备的混合适配体，对9种磺胺类药物（磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺喹噁啉、磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺眯、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺嘧啶）具有强的特异结合力，且对硫酸卡那霉素（kana）、四环素（tc）、恩诺沙星（(enr）、头孢噻肟（ctx）、苯唑西林（oxcl）和氨苄西林（amp）等6种其他常用抗生素没有结合力（如图3），可见其可克服已有磺胺类药物核酸适配体只能识别结合单一磺胺类药物、或存在恩诺沙星干扰以及结合力较低等缺点，用于发展构建各种不同的快速、低成本、高灵敏、无干扰的9种磺胺类药物残留同时检测的新方法和新技术。

20、（2）本发明所开发的以sul-01和sul-04混合适配体为探针构建的同时高灵敏检测水环境和海产品中9种磺胺类药物（磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺喹噁啉、磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺眯、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺嘧啶）的比率型荧光检测方法具有操作简单、快速、灵敏度高（理论检测限3σ/s达到0.05µm）、稳定性好、无干扰和低成本等优点，可直接用于湖水和海产品中上述9种磺胺类抗生素残留快速筛查和精准检测，无需其它附加处理过程。