一种丝状酵母样真菌发酵产物的制备方法与流程

本发明涉及化妆品制造的真菌发酵领域，主要涉及一种丝状酵母样真菌的多重发酵。

背景技术：

1、化妆品作为日常生活中常用的日用品受到大众广泛重视，面部护肤品是其中重要的一个分支，往往具有抗炎、保湿、美白、抗衰等效果。随着化妆品行业的发展与大众喜好的变迁，有很大一部分消费群体倾向于含有生物活性物质的面部护肤品而不选择以化学合成物质为主的化妆品。从化妆品行业发展趋势看来，各化妆品公司开始逐渐使用中草药、真菌类天然物作为原料制造化妆品。

2、丝状酵母样真菌属于半乳糖酵母样菌的一种，半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(别名：覆膜酵母菌发酵产物滤液。又名：pitera，拉丁名：saccharomycopsis ferment filtrate，galactomyces ferment filtrate)，常应用在护肤品的制造中，有美白祛斑、抗氧化衰老、保湿抗炎等效果。半乳糖酵母样菌发酵产物滤液为一种天然酵母萃取物，会产生包括维他命b群、矿物质、氨基酸等有益护肤的小分子。目前半乳糖酵母样菌发酵产物滤液主要以葡萄糖等糖源作为营养物质进行发酵，产物滤液作为化妆品原材料与其他成分复配作用。如专利cn115554199a等类似专利即直接采用市面可购买的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液为成分。

3、松茸是一种名贵的野生食用菌，有很高的营养价值和特殊的药用效果。具有强身、易畅健胃、止痛、理气化痰、驱虫等作用。往往利用于食品领域，在化妆品领域应用较少。灵芝一直以来作为药材来使用，对高血压、高胆固醇血症、肝炎、胃炎、糖尿病、支气管炎以及心血管疾病等有效，最近致力于与抗癌治疗有关的研究中，当灵芝被用于化妆品领域，现已探索了其抗老化、美白功效。大米在化妆品领域往往用于保湿，以大米提取液作为主要成分(其富含y-谷维素、稻糠甾醇和原花青素等成分)，有性质温和安全，具有较强的润白功效，并可补充肌肤所缺失水分，使肌肤光滑细腻，充满弹性。白松露是高级的食物调味料，近来被发现也具有一定的药用价值，如提高免疫力和高血脂症。在护肤品领域，白松露被用于美白、抗老化。

4、目前更多含有天然物成分的化妆品更多直接采用天然物中提取的活性成分的，而没有利用微生物发酵以增加其效用。目前市面上售卖的真菌发酵产物滤液更多为酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、毕赤酵母、酒香酵母、丝孢子酵母、清酒酵母等发酵产物，且并未提及发酵工艺对其安全性和功效的提升。

5、专利cn115125153b采用半乳糖酵母样真菌，以乳糖、葡萄糖、蛋白胨等常见碳源氮源为发酵底物，发酵产物滤液具有护肤效果，但并未充分探索此类菌种的天然物材料的发酵产物具有的更高的价值，且并未提及发酵工艺对其安全性和功效的提升。

6、专利cn115161207a采用了半乳糖酵母样菌发酵产物滤液用于化妆品制造，其目的护肤功效为淡化皱纹和保湿，但其采用的发酵底物为泽兰多糖等糖源，在发酵底物的选择上相当于普通多糖，且只采用了单次发酵。证明了半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有切实的护肤功效，却未考虑其发酵工艺的成本与效益。专利cn114250156a和专利cn115554226a均采用单次发酵，未能通过多次发酵提高发酵产物的细胞安全性和护肤功效。专利cn115554226a采用的多重菌株发酵是指，采用了不同菌种混合单次发酵，与本发明所指多重发酵具有本质上的不同。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明提供一种丝状酵母样真菌发酵产物的制备方法，在制备过程中采用多重发酵工艺流程。在丝状酵母样真菌多重发酵后，相比于单次发酵：其产物具有更高的细胞安全性，即提高发酵产物的安全浓度范围；发酵产物中护肤有益活性成分具有更好的护肤效果。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、一方面，本发明提供一种丝状酵母样真菌galactomyces citri-aurantii发酵产物的制备过程中的多重发酵工艺流程。所述的多重发酵为，前一次发酵结束离心得到的沉淀物灭菌后用于后一次发酵的培养基成分，所述多重发酵的发酵次数为2～7次。以上一次发酵结束离心得到的沉淀物作为下次发酵培养基的一部分，沉淀物中的真菌细胞中含有几丁质、脂质、蛋白质、小分子氨基酸、多种小分子糖等物质，在灭菌后细胞破碎释放出的活性物可以进一步溶解到发酵液中，提高效能；同时也能作为菌生长再次利用的一部分，兼顾了降低成本和增加效益两个目的。经实验证明，对于丝状酵母样真菌，采用沉淀进行多重发酵相比于不采用沉淀的多次发酵，多重发酵过程中发酵细胞活力更强，发酵产物中活性蛋白、氨基酸含量更高，发酵产物的细胞安全性更好，具有更高的细胞安全浓度范围。

4、优选的，所述丝状酵母样真菌发酵过程中，发酵次数为4次。经实验证明，在发酵次数为4次时，丝状酵母样真菌以天然物为发酵底物的的代谢产物相比于其他次数的多重发酵具有更高的安全浓度范围，丝状酵母样真菌的松茸、灵芝、白松露、白柳树皮四重发酵产物相比于单次发酵对细胞的安全浓度均提升1～4倍，使发酵产物扩大细胞安全浓度的范围，提高发酵产物的作用浓度，从而具有更好的作用效果。且相比于其他次数的发酵，相同发酵产物浓度下四重发酵可以达到最高的细胞存活率。同时，经实验证明，采用多重发酵，总发酵次数为4时，其代谢产物中有益活性物质的护肤功效最为良好。

5、进一步的，所述丝状酵母样真菌的发酵还包括以下步骤：

6、(1)培养丝状酵母样真菌，获得接种液；

7、(2)将接种液接种到液体天然物培养基进行首次发酵；

8、(3)收集每次发酵结束时离心产生的上清液，混合后即作为发酵产物。

9、进一步的，液体天然物培养基含有天然物成分和纯水，所述天然物为松茸、灵芝、大米、白松露、白柳树皮等天然材料中的一种或多种；从第二次发酵开始，每次收集前一次发酵结束离心得到的沉淀物，灭菌后加入补充营养液配置成扩大发酵培养基，再次接种、发酵；所述补充营养液为蔗糖无菌营养液。经实验证明，采用松茸、灵芝、大米、白松露、白柳树皮作为丝状酵母样真菌的发酵底物，多重发酵能够明显提升效益，而传统采用多糖作为发酵底物，则不能通过多重发酵明显提升发酵产物的护肤功效。

10、进一步的，当培养丝状酵母样真菌获得的接种液的吸光度od≥1.5时可用于接种首次发酵，接种液与液体天然物培养基的体积比为1:1000，发酵温度为26℃±3℃，发酵时间为72h。

11、进一步的，所述步骤(2)中，扩大发酵培养基中沉淀物与补充营养液的体积比为1:(500～2000)。

12、优选的，所述步骤(2)所述扩大发酵培养基中沉淀物与补充营养液的体积比为1:1000。

13、进一步的，所述液体天然培养基的配置方法为，天然物筛选后粉末化后与纯水按照体积比1:(20～30)的比例混合，高温灭菌处理，形成半固态膏状且静置后分层(上层悬浊清液与下层浑浊沉淀物)，密封保存于冷库(4℃)备用。

14、优选的，粉末化后天然物与纯水混合比例为1:20。

15、进一步的，所述丝状酵母样真菌为galactomyces citri-aurantii购自中国微生物菌种网，购买网址为https://www.biobw.org/china-strain/bio-113662.html。

16、另一方面，本发明提供一种上述方法制备的丝状酵母样真菌发酵产物。以丝状酵母样真菌为发酵菌株，采用松茸、灵芝、大米、白松露、白柳树皮中的一种或多种天然物制备培养基，采用上述多重发酵制备方法，所得产物包括：具有炎症修护舒缓功效的丝状酵母样真菌松茸发酵产物及丝状酵母样真菌白柳树皮发酵产物、促胶原蛋白生成抗皱功效的丝状酵母样真菌灵芝发酵产物、具有保湿功效促透明质酸生成的丝状酵母样真菌大米发酵产物、具有美白功效抑制酪氨酸酶的丝状酵母样真菌白松露发酵产物。

17、再一方面，本发明提供多重发酵在提高丝状酵母样真菌以松茸、灵芝、大米、白松露、白柳树皮等为发酵底物的发酵产物的活性成分含量的用途。多重发酵提高有益活性成分的积累含量，可以提高发酵液中氨基酸含量水平，从而改良发酵产物的作用效果。经实验验证，通过多重发酵，不仅提高了有益活性成分的含量，还提高了发酵产物对细胞的安全浓度范围，使发酵产物中的活性成分有更大的发挥空间，使最终产品达到更优的作用效果。经实验证明，丝状酵母样真菌采用天然物多重发酵提高产物的安全性和护肤功效的有益效果，多重发酵对丝状酵母样真菌发酵有专门作用，对酿酒酵母则并不带来更好的效果，从而将丝状酵母样真菌与其他发酵菌种区分开来。经实验证明，丝状酵母样真菌采用多糖为发酵底物时，其多重发酵并不能进一步提升护肤功效，可以证明本发明所采用的发酵底物，即天然物的添加在多重发酵提升效益是不可或缺的。

18、多重发酵工艺中采用发酵沉淀物作为下次发酵培养基的一部分，将沉淀物灭菌后用作培养基可以提高生物安全性的原因是，真菌在发酵过程中的次级代谢产物会有抑制其他微生物生长效果，具有一定的生物毒性，而在多重发酵的积累过程中这类有害物质的分泌减少，或者与积累的有益活性成分的作用效果相平衡减弱了危害。经实验验证，在不采用沉淀物进行下一次发酵而每次采用新制培养基进行多次发酵的情况下，相同浓度发酵产物的细胞安全性不如多重发酵高，表现为其细胞存活率相比于多重发酵更低，作用效果而言，发酵后其中氨基酸含量的增加也不如多重发酵明显。

19、再一方面，本发明提供丝状酵母样真菌用于经天然物发酵制备高活性成分含量发酵产物的用途，丝状酵母样真菌为galactomyces citri-aurantii，购自中国微生物菌种网，购买网址为https://www.biobw.org/china-strain/bio-113662.html。天然物为松茸、灵芝、大米、白松露、白柳树皮中的一种或多种。

20、与现有技术相比，本发明所具有以下有益效果：

21、本发明提供的一种丝状酵母样真菌galactomyces citri-aurantii发酵产物的制备方法，采用了多重发酵工艺流程。采用上一次发酵的沉淀物进行多重发酵相比于不采用沉淀的多次发酵：1.发酵菌种细胞活力更高，2.发酵产物积累后有益活性成分含量更多，3.发酵产物细胞安全性更高。

22、本发明所采用的丝状酵母样真菌，采用多重发酵，即前一次发酵结束离心得到的沉淀物灭菌后用于后一次发酵的培养基成分。此发酵工艺使有益物质积累，所得发酵产物具有更高的蛋白含量水平，其发酵产物滤液具有更高的细胞安全浓度范围。经实验证明，丝状酵母样真菌利用天然培养基时，采用四重发酵时，相比于其他次数的多重发酵的发酵产物安全性最高，护肤功效最好。

23、本发明提供的一种四重发酵的丝状酵母样真菌发酵产物，采用松茸、灵芝、大米、白松露、白柳树皮中的一种，这些材料作为发酵底物时采用多重发酵能够提高护肤功效，而采用多糖为发酵底物时，则不能通过多重发酵提升护肤功效。由于发酵底物中的松茸、灵芝、白松露价格高昂，作为发酵底物时采用多重发酵可充分利用其中的效用价值，且在各个发酵步骤重复利用，节省工艺成本。经对比实验证明，在多重发酵的发酵次数为4时，以上天然物的发酵产物均具有最高的细胞安全性与最好的护肤功效。