一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基及其培养方法与流程

本发明涉及生物领域技术，尤其是指一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基及其培养方法。

背景技术：

1、糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷或胰岛β细胞生物功能受损，进一步引起以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病会引起代谢紊乱综合征如多尿、多饮、多食和体重下降，急性并发症和伴发病如糖尿病酮症酸中毒等，慢性并发症如糖尿病足、神经性病变等，严重地威胁着人们的生活质量。胰岛移植是有效治疗糖尿病的重要途径之一，但由于健康的胰岛来源非常有限，存在供体严重不足的现实情况，并且移植后所产生的免疫排斥现象不可避免，因此寻找安全有效且来源充足的胰岛代替品具有重大的意义。

2、干细胞是公认的一类具有不断自我更新能力和高度分化潜力的细胞，它们具有向胚内多种细胞分化的能力。已有报道称，由人多能干细胞分化得到的胰岛β细胞与胰岛β细胞功能相近，具有良好的降血糖及逆转糖尿病的功能，因此，使用人多能干细胞分化获得的胰岛β细胞可作为供体来源胰岛β细胞的良好替代品。

3、有研究报道，通过在体外添加小分子可以激活或抑制某些信号通路来模拟胰岛在体内的发育过程。在体外，多能干细胞诱导分化至胰岛β细胞大致需要经历6个阶段，分别是：定型内胚层细胞阶段，原始肠管阶段，后前肠阶段，胰腺内胚层阶段，胰腺内分泌祖细胞阶段，未成熟胰腺β细胞阶段，胰腺β细胞阶段。其中定型内胚层阶段的分化效率至关重要，直接影响到最终形成胰腺β细胞的效率。

4、至今，由干细胞分化为定型内胚层细胞的不同方案已经被报道。转化生长因子β(tgf-β)家族成员及wnt信号通路激活剂在内胚层形成阶段至关重要。高浓度的activin a及低浓度的chir99021被广泛用于内胚层形成。大部分研究所使用的activin a的浓度较高，约为100ng/ml-115ng/ml，使得分化成本偏高；因此，针对此现状，迫切需要开发一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基及其培养方法，以满足实际使用的需要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基及其培养方法，将人多能干细胞在多种小分子组合的作用下分化为定型内胚层阶段的细胞，其培养基化学成分明确，成本相较于现有的培养基更低，且分化效率更高，操作简单，具有良好的应用前景。

2、为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：

3、一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基，所述培养基以mcdb131为基础培养基，还包括以下组分：4.5mm葡萄糖、1％谷氨酸盐、1％青-链霉素双抗、1％b27、250μm维生素c、20-30ng/ml tgf-β激活剂、1-10μm jnk-jun抑制剂、10nm-100nmpi3k/mtor抑制剂、0.3μm-3μm wnt信号通路激活剂和10μm rock抑制剂。

4、作为一种优选方案：所述培养基于第一天添加tgf-β激活剂的使用浓度为20-30ng/ml，wnt信号通路激活剂的使用浓度为0.3μm-3μm，所述培养基于第二天tgf-β激活剂的使用浓度为20-30ng/ml，wnt信号通路激活剂的使用浓度为0.3μm-3μm，所述培养基于第三天tgf-β激活剂的使用浓度为20-30ng/ml。

5、作为一种优选方案：所述培养基于第一天添加wnt信号通路激活剂的使用浓度为3μm，jnk-jun抑制剂使用浓度为1μm-10μm，pi3k/mtor抑制剂使用浓度为10nm-100nm，rock抑制剂使用浓度为10μm。

6、作为一种优选方案：所述培养基于第二天wnt信号通路激活剂的使用浓度为0.3μm。

7、作为一种优选方案：所述tgf-β激活剂为activin a；所述wnt信号通路激活剂为chir99021；所述jnk-jun抑制剂为jnk-in-8；所述pi3k/mtor抑制剂为pi103；所述rock抑制剂为y27632。

8、作为一种优选方案：所述人多能干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

9、一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养方法，其采用所述的培养基对人多能干细胞进行培养，将其分化为定型内胚层细胞。

10、作为一种优选方案：所述将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养方法包括以下步骤：

11、s1、对人胚胎干细胞扩增培养；

12、s2、人胚胎干细胞诱导形成定型内胚层细胞。

13、作为一种优选方案：所述s1中的对人胚胎干细胞扩增培养包括步骤1：将人胚胎干细胞用mtesr1培养基于37℃二氧化碳培养箱至细胞融合度达80％-90％；以及步骤2：使用accutase消化人胚胎干细胞至单细胞，按照每孔2.7×105cells/孔接种于铺有稀释比例为1：100的growth factor reduced-matrigel 24孔板中，采用mtesr1培养基培养24h。

14、作为一种优选方案：所述s2中的人胚胎干细胞诱导形成定型内胚层细胞包括步骤a：配制定型内胚层阶段第一天培养基，将人胚胎干细胞使用所述培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；步骤b：配制定型内胚层阶段第二天培养基，将经过上述步骤a培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第二天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；以及步骤c：配制定型内胚层阶段第三天培养基，将经过上述步骤b培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第三天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h。

15、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，

16、第一、本发明提供的培养基成分明确，性能稳定，将人多能干细胞在多种小分子组合的作用下分化为定型内胚层阶段的细胞，对后续往胰岛β细胞分化至关重要，具有良好的应用前景。

17、第二、培养基中通过同时加入wnt信号通路激活剂、pi3k/mtor抑制剂及jnk-jun抑制剂，可以降低tgf-β激活剂的使用量，大大降低了分化的成本。

18、第三、培养基中tgf-β激活剂使用量减少的同时并没有降低分化效率。

19、第四、本发明提供的将人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养方法，采用了成分明确的专用培养基，将人多能干细胞简单快速的分化为定型内胚层细胞，在不降低分化效率的同时大大降低了分化成本。

20、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。

技术特征：

1.一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基，其特征在于；所述培养基以mcdb131为基础培养基，还包括以下组分：4.5mm葡萄糖、1％谷氨酸盐、1％青-链霉素双抗、1％b27、250μm维生素c、20-30ng/mltgf-β激活剂、1-10μmjnk-jun抑制剂、10nm-100nmpi3k/mtor抑制剂、0.3μm-3μmwnt信号通路激活剂和10μmrock抑制剂。

2.根据权利要求1所述的一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基，其特征在于；所述培养基于第一天添加tgf-β激活剂的使用浓度为20-30ng/ml，wnt信号通路激活剂的使用浓度为0.3μm-3μm，所述培养基于第二天tgf-β激活剂的使用浓度为20-30ng/ml，wnt信号通路激活剂的使用浓度为0.3μm-3μm，所述培养基于第三天tgf-β激活剂的使用浓度为20-30ng/ml。

3.根据权利要求2所述的一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基，其特征在于；所述培养基于第一天添加wnt信号通路激活剂的使用浓度为3μm，jnk-jun抑制剂使用浓度为1μm-10μm，pi3k/mtor抑制剂使用浓度为10nm-100nm，rock抑制剂使用浓度为10μm。

4.根据权利要求2所述的一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基，其特征在于；所述培养基于第二天wnt信号通路激活剂的使用浓度为0.3μm。

5.根据权利要求1所述的一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基，其特征在于；所述tgf-β激活剂为activina；所述wnt信号通路激活剂为chir99021；所述jnk-jun抑制剂为jnk-in-8；所述pi3k/mtor抑制剂为pi103；所述rock抑制剂为y27632。

6.根据权利要求1所述的一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基，其特征在于；所述人多能干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

7.一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的培养基对人多能干细胞进行培养，将其分化为定型内胚层细胞。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述s1中的对人胚胎干细胞扩增培养包括步骤1：将人胚胎干细胞用mtesr1培养基于37℃二氧化碳培养箱至细胞融合度达80％-90％；以及步骤2：使用accutase消化人胚胎干细胞至单细胞，按照每孔2.7×105cells/孔接种于铺有稀释比例为1：100的growthfactorreduced-matrigel24孔板中，采用mtesr1培养基培养24h。

10.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述s2中的人胚胎干细胞诱导形成定型内胚层细胞包括步骤a：配制定型内胚层阶段第一天培养基，将人胚胎干细胞使用所述培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；步骤b：配制定型内胚层阶段第二天培养基，将经过上述步骤a培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第二天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；以及步骤c：配制定型内胚层阶段第三天培养基，将经过上述步骤b培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第三天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h。

技术总结
本发明公开一种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基及其培养方法，涉及生物技术领域，该种将人多能干细胞定向分化为定型内胚层细胞的培养基包括以MCDB131为基础培养基，还包括以下组分：4.5mM葡萄糖、1％谷氨酸盐、1％青‑链霉素双抗、1％B27、250μM维生素C、20‑30ng/mL TGF‑β激活剂、1‑10μMJNK‑JUN抑制剂、10nM‑100nMPI3K/mTOR抑制剂、0.3μM‑3μMWnt信号通路激活剂和10μMROCK抑制剂；使人多能干细胞分化为定型内胚层细胞。该培养基化学成分明确，可以促进人多能干细胞往定型内胚层发育，后续可用于内胚层谱系的细胞的分化，操作简单，具有良好的应用前景。

技术研发人员：高云峰,许静玉,温俊杰,肖丹,程艳红,蔡车国,胡隽源
受保护的技术使用者：深圳市北科源细胞科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13