一种体外高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法

本发明属于干细胞领域，尤其是涉及一种体外高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法。

背景技术：

1、利用转染外源转录因子以及小分子化合物组合等诱导方法，在人、小鼠等多个物种均已经实现将终末分化体细胞重编程为神经元。2015年裴钢课题组报道了利用7个小分子化合物组合，将阿尔茨海默症患者的成纤维细胞重编程为神经元。2005年brueckner b等利用6种小分子化合物的组合，将人星形胶质细胞诱导为神经元。这些小分子化合物抑制了非神经元基因的表达，促进神经元特异基因的表达，通过对于诱导后细胞的延长培养，最终获得成熟的功能性神经元。

2、虽然现在诱导神经元的方法种类有很多，但是均存在诱导时间过长(20～30天)，诱导效率偏低(10％～30％)，方法过度繁琐以及潜在的生物安全风险偏高等缺点。在细胞治疗应用方面来看，现有技术由于使用的诱导因素过多、诱导时间过长、效率偏低都会大大降低临床治疗的效果，增加潜在的治疗副作用以及生物安全性的担忧。在机理方面来说，现有的技术是使用多种小分子化合物的联合作用，作用的信号通路交错，作用位点繁杂，无法准确揭示体细胞向神经元命运的转化是如何决定的。目前没有任何技术阐述可以利用单一小分子化合物将体细胞重编程为神经元细胞，并且也未能完全阐明体细胞重编程为神经元的机理。

3、而本发明的诱导体系可以在只使用单个小分子化合物或者单一基因的调控作用的前提下两天内将体细胞重编程为具有tuj1阳性的神经元细胞(最高阳性率约80％)。更重要的是，前人使用的小分子化合物组合的方法无法阐述细胞命运转化的机理。我们的发现清楚的阐明了人体细胞重编程为神经元细胞的分子调控路径，确定了单一小分子化合物或者单一基因的调控作用可以诱导人体细胞重编程为神经元细胞。另外本发明中提到的重编程的关键调控位点前人都还没有报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在提出一种体外高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，以克服现有技术的缺陷,确定了单一小分子化合物或者单一基因的调控作用可以诱导人体细胞重编程为神经元细胞。

2、一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，提高camp的浓度或上调pka、creb任一位点的表达或抑制ampk、alk2、alk3、p38、jnk任一位点的表达。

3、优选地，使用小分子化合物、基因干扰、基因敲除或基因过表达提高camp的浓度或上调pka、creb任一位点的表达或抑制ampk、alk2、alk3、p38、jnk任一位点的表达，优选地，小分子化合物包括camp激活剂、camp、camp类似物、pka激活剂、creb激活剂、ampk抑制剂、alk2抑制剂、alk3抑制剂、p38抑制剂、jnk抑制剂中的一种或两种以上。

4、诱导人体细胞重编程为神经元细胞的各作用位点及作用该位点的小分子化合物，作用位点包括camp(提高浓度),pka(激活/上调表达)，creb(激活/上调表达)，alk2/3(抑制/下调表达)，jnk(抑制/下调表达),p38(抑制/下调表达),ampk(抑制/下调表达)。下列任何单一小分子化合物，包括(不仅限于)camp/pka/creb激活剂(forskolin/colforsin/8-bromo-camp/dibutyryl-camp(bucladesine)/camp及其类似物等)，alk2/3抑制剂(ldn-193189/ldn-193189-2hcl/k02288/ldn-212854/ldn-214117/ml347/dmh1/等)，jnk抑制剂(sp600125/resveratrol/jnk-in-8/jnk-inhibitorviii/db07268/iq-1s/bentamapimod(as602801)/tanzisertib(cc-930)/bi-78d3/jnk inhibitorix/urolithinb/loureirinb/loureirinb/falcarindiol/cucurbitaciniib/mulberrosidea/trans-zeatinastragaloside iv等)，p38抑制剂(sb203580/doramapimod(birb796)/sb202190(fhpi)/ralimetinib dimesylate/vx-702/ph-797804/vx-745/tak-715/pd169316/ta-02/sd0006/pamapimod/bms-582949/sb239063/losmapimod(gw856553x)/skepinone-l/sea0400/auda/praeruptorina/mulberrosidea/um-164/trans-zeatin/3'-hydroxypterostilbene/p exmetinib(arry-614)等)，ampk抑制剂(dorsomorphin/wz4003/on123300/hth-01-015/gsk690693/xmd-17-51/dorsomorphin(compoundc)/dorsomorphin(compoundc)2hcl/doxorubicin(adriamycin)hcl等)，都可以诱导人皮肤成纤维细胞、人卵泡颗粒细胞、人星形胶质细胞等体细胞重编程为功能性神经元的方法。

5、本发明的第二目的在于提供一种用于高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的诱导培养基，包括基础液、ksr以及小分子化合物，优选地，小分子化合物包括camp激活剂、camp、camp类似物(如dbcamp、8-cl-camp等)、pka激活剂、creb激活剂、ampk抑制剂、alk2抑制剂、alk3抑制剂、p38抑制剂、jnk抑制剂中的一种或两种以上。

6、优选地，小分子化合物包括forskolin、8-bromo-camp、ldn193189、camp、camp类似物、sp600125、sb203580、dorsomorphin，且在最终培养基中，各自的浓度依次分别为0-100μm、0-500μm、0-25μm、0-10mm、0-10mm、0-10μm、0-5μm、0-100μm，以上各物质浓度不同时为0；优选地，各自的浓度依次分别为5-20μm、5-50μm、0.5-5μm、0.5-5mm、0.5-5mm、0.5-5μm、0.1-2.5μm、0.5-20μm；更优选地，各自的浓度依次分别为10μm、50μm、2.5μm、1mm、1mm、1μm、0.5μm、10μm。

7、优选地，基础液、ksr的体积比为80:20；优选地，基础液为n2b27，包括knockoutdmem/f12、n2(100×)、neurobasal、b27(50×)、glutamine(100×)；且几者的体积比为99:1:97:2:1。

8、本发明的第三目的在于提供上述的诱导培养基在体内外诱导体细胞重编程为神经元细胞中的应用。

9、本发明的第四目的在于提供一种使用诱导培养基进行体外诱导体细胞重编程为神经元细胞的方法，包括如下步骤：

10、1)将体细胞接种于培养皿中，接种后加入高糖dmem+10％fbs，置于5％二氧化碳，湿度95％，37℃的培养箱，培养过夜后更换如权利要求3-5任一项所述的诱导培养基，诱导培养48h后获得诱导神经元(cincs)；

11、2)将培养基更换为神经元成熟培养基，继续促进诱导后的神经元进一步成熟，72h后更换为神经元培养基，可进行长时间培养。

12、优选地，神经元成熟培养基的成分包括体积比为1:1的dmem/f12和neurobasal，0.5％n2(体积百分比)，1％b27(体积百分比)，100μm camp，20ng/ml bfgf，20ng/ml bdnf，20ng/ml gdnf，20ng/ml nt3，100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。

13、优选地，神经元培养基的成分包括体积比1:1的dmem/f12：neurobasal，0.5％n2(体积百分比)，1％b27(体积百分比)，20ng/ml bfgf，20ng/ml bdnf，20ng/ml gdnf，20ng/ml nt3，100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。

14、所述体细胞来源于人、猴子或小鼠；所述体细胞为皮肤成纤维细胞、卵泡颗粒细胞或星形胶质细胞。

15、相对于现有技术，本发明所述的高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法具有以下有益效果：

16、(1)本专利填补了利用单一小分子化合物诱导终末分化人体细胞重编程为功能性神经元的一个空白。

17、(2)本专利填补了调控单一基因的表达(pka、creb、jnk)诱导终末分化人体细胞重编程为功能性神经元的一个空白。

18、(3)本专利在使用单一小分子化合物的条件下，在仅仅两天左右的诱导时间下，就能获得大约80％tuj1阳性率的神经元细胞。相比于前人的工作，诱导时间大大缩短，诱导效率大大提高。

19、(4)本专利利用单一小分子化合物作用通路明确以及作用位点清晰的特点，阐明了体细胞重编程为神经元的整个重编程过程的分子调控路径为camp-pka-creb-jnk以及其关键调控基因为pka、creb和jnk。此机理还未曾有人明确阐述。

20、(5)本专利诱导小分子化合物单一和安全，诱导时间短、诱导效率高以及机制清楚，可以将其应用于人神经退行性疾病的临床治疗中，为神经退行性疾病的治疗提供一种更加安全高效的治疗手段。我们利用本专利可以将成纤维细胞和星形胶质细胞在体内外进行诱导，源源不断的在体内外获得大量的诱导神经元，从而利用再生的这些诱导神经元达到在临床上治疗神经退行性疾病的目的。