一种用于遗传性凝血因子缺乏病治疗的核酸构建体及其用途的制作方法

本发明涉及基因治疗，特别是涉及用于遗传性凝血因子缺乏病治疗的核酸构建体及其用途。

背景技术：

1、血小板凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。这些因子的共同作用是维持在出血状态下正常的凝血生理功能。如果一种或多种凝血因子缺失，会导致一组遗传性出血性疾病——血友病。其中临床上最常见的a型血友病是一种由凝血因子viii缺乏所引起的x连锁隐性遗传病。患者出现严重程度不等的凝血功能障碍及自发性出血。血友病b是凝血因子ⅸ基因突变引起血浆fix量的缺乏或质的缺陷所导致的一种x连锁隐性遗传性出血性疾病，在男性中的发病率约为1/30000。

2、凝血因子替代疗法，作为目前血友病唯一的治疗手段，既包括早期的血浆衍生(plasma-derived,pd)凝血因子，也包括由基因工程生产的重组人凝血因子蛋白产品。这些产品不仅价格昂贵，且长期应用会产生抑制因子。以aav或者慢病毒载体作为递送手段的基因治疗通过将凝血因子蛋白编码基因永久性地整合到人体细胞中或长期植入到非分裂细胞中，可以起到由人体细胞自体持续表达具有完全功能的凝血因子的效果。因其可预见的长效性及安全性，基因治疗成为血友病治疗最具前景的治疗手段。

3、近年来，在血友病临床应用上，aav载体递送以肝脏为靶器官逐渐成为主流趋势，比如biomarin的bmn 270、uniqure的amt-061等产品，均已开展至临床iii期试验。然而这种技术路线无法避免药物产生肝脏毒性的风险。2020年11月16日，国际顶尖学术期刊nature子刊nature biotechnology杂志发表了一篇题为：a long-term study of aav genetherapy in dogs with hemophilia a identifies clonal expansions of transducedliver cells的研究论文，该研究对患有a型血友病的狗进行的aav病毒基因治疗试验，而在治疗后长达十年的观测中，研究团队发现aav病毒携带的治疗性基因片段有些被整合到了狗的染色体上控制生长的基因附近，有诱发癌症的可能性。另外目前血友病b主要治疗方式还是凝血因子替代疗法，凝血因子经过血源→重组→长效的发展历程，但是患者需要终生用药，虽然这可在一定程度上控制疾病，但仍有出血风险，也给患者带来许多副作用和很大的经济负担。因此，全球有很多基因治疗公司试图以一次性方式，利用病毒载体递送fix基因的功能性拷贝至患者体内，使肝脏表达缺失的凝血因子，从而消除患者的出血风险，达到治疗益处。目前临床上的几款基因治疗的药也已进展到临床阶段，如pfizer(spark)的spk-9001-ltfu101、uniqure的amt-061等，尤其是uniqure的amt-061已进入到3期临床，在2020年12月22日，uniqure公司宣布暂停其治疗b型血友病的iii期临床，原因是amt-061的临床实验中报告了一例肝癌患者病例。

4、为避免肝脏毒性和肝癌隐患，血友病基因治疗必须探索更为安全且有效的aav载体及给药方式，改变aav药物在人体内的组织分布，使其成为一种具有显著安全性优势的基因治疗药物。而且现有的aav递送至体内后表达的fix量较小，不能满足治疗疾病所需的血药浓度，因此同时需要开发能满足治疗疾病所需血药浓度的aav。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于遗传性凝血因子缺乏病治疗的核酸构建体及靶向肌肉的aav载体血清型的新用途，用于解决现有技术中的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括以下元件：

3、编码凝血因子ix的多核苷酸；

4、aav顺式作用元件，所述aav顺式作用元件包括itr、启动子、kozak序列、sv40polya、utr或wpre中的一种或多种。

5、优选的，所述编码凝血因子ix的多核苷酸序列为经过密码子优化的序列，优选的，所述经过密码子优化的多核苷酸序列为包括r338l突变的凝血因子ix的序列；优选的，所述经过密码子优化的多核苷酸的序列如seq id no:23所示或为与seq id no:23所示的序列具有95％相似性的序列。

6、所述启动子选自哺乳动物组成型启动子、哺乳动物组织特异性启动子或哺乳动物诱导型启动子。

7、所述核酸构建体的结构选自以下任一：

8、1)itr-启动子-kozak序列-f9idtm基因表达框-sv40 polya序列-itr；

9、2)itr-启动子-kozak序列-f9idtm基因表达框-wpre-sv40 polya序列-itr；

10、3)itr-启动子-utr序列-kozak序列-f9idtm基因表达框-wpre-sv40 polya序列-itr。

11、本发明提供靶向肌肉的aav载体血清型在制备遗传性凝血因子缺乏病治疗产品中的用途。

12、所述靶向肌肉的aav载体血清型选自aav1、aav2、aav6、aav6.2ff、aav7、aavrh74、aav8、aav9或它们的突变体。

13、所述遗传性凝血因子缺乏病治疗产品选自核酸构建体或腺相关病毒。

14、所述遗传性凝血因子缺乏病选自a型血友病、b型血友病或c型血友病。

15、本发明还提供一种用于制备遗传性凝血因子缺乏病治疗产品的核酸构建体，以该核酸构建体制备的腺相关病毒具有肌肉偏向性，并表达治疗有效剂量的凝血因子；优选的，所述核酸构建体在肌肉注射的递送方式下，具有肌肉偏向性。

16、本发明还提供一种腺相关病毒载体系统，所述腺相关病毒载体系统包括前述的两种核酸构建体。

17、本发明还提供一种腺相关病毒，所述腺相关病毒所述腺相关病毒载体系统包装而成。

18、本发明还提供一种细胞系，其特征在于，所述细胞系为经所述腺相关病毒感染的细胞系。

19、本发明还提供所述腺相关病毒、所述细胞系在制备预防、治疗遗传性凝血因子缺乏病的产品中的用途。

20、本发明还提供一种治疗遗传性凝血因子缺乏病的方法，所述方法包括向患者给予有效量的腺相关病毒。

21、如上所述，本发明的提供靶向肌肉的aav载体血清型的新用途，具有以下有益效果：提供了更为安全且有效的aav载体及给药方式，改变aav药物在人体内的组织分布，使其成为一种具有显著安全性优势的基因治疗药物。提高了fix的表达量，其表达的量足够大，能满足治疗疾病所需的血药浓度。在达到治疗效果的同时减少aav的使用量。不会导致肝毒性，相比现有的治疗方法更加安全有效。

技术特征：

1.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括以下元件：

2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述编码凝血因子ix的多核苷酸序列为经过密码子优化的序列，优选的，所述经过密码子优化的多核苷酸序列为包括r338l突变的凝血因子ix的序列；优选的，所述经过密码子优化的多核苷酸的序列如seq id no:23所示或为与seq id no:23所示的序列具有95％以上相似性的序列。

3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述启动子选自哺乳动物组成型启动子、哺乳动物组织特异性启动子或哺乳动物诱导型启动子。

4.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述启动子选自肌肉组织特异性启动子；优选的，所述肌肉组织特异性启动子选自tmck、desmin、skcrm 4-des、tmck2、ck8或mck。

5.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述itr的长度为130～145bp；优选的，所述itr的长度为130bp、141bp或145bp；更优选的，所述上游itr和下游itr的长度相同，均为141bp。

6.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的结构选自以下任一：

7.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为腺相关病毒载体。

8.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述腺相关病毒载体还包括载体骨架；优选的，所述载体骨架为paav-mcs-itr-130-cag-sv40，核苷酸序列如seq id no：1所示。

9.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的核苷酸序列选自以下任一：seq id no:22、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:8、seq id no:15、seq idno:17、seq id no:19、seq id no:21。

10.靶向肌肉组织的aav载体血清型在制备遗传性凝血因子缺乏病治疗产品中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述靶向肌肉的aav载体血清型选自aav1、aav2、aav6、aav6.2ff、aav7、aavrh74、aav8、aav9或它们的突变体。

12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述遗传性凝血因子缺乏病治疗产品选自核酸构建体或腺相关病毒。

13.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述遗传性凝血因子缺乏病选自a型血友病、b型血友病或c型血友病。

14.一种用于制备遗传性凝血因子缺乏病治疗产品的核酸构建体，其特征在于，以该核酸构建体制备的腺相关病毒具有肌肉偏向性，并表达治疗有效剂量的凝血因子；优选的，所述核酸构建体在肌肉注射的递送方式下，具有肌肉偏向性。

15.根据权利要求14所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括表达腺相关病毒衣壳蛋白的载体骨架；优选的，腺相关病毒衣壳蛋白载体骨架表达靶向肌肉组织的腺相关病毒衣壳蛋白。

16.根据权利要求15所述的核酸构建体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白载体骨架为kl-paav-rc1、kl-paav-rc2、kl-paav-rc6、kl-paav-rc6.2ff、kl-paav-rc7、kl-paav-rcrh74、kl-paav-rc8、kl-paav-rc9，核苷酸序列依次如seq id no.

17.一种腺相关病毒载体表达系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统包括权利要求1～9任一所述的核酸构建体和权利要求14～16任一所述的核酸构建体。

18.根据权利要求17所述的腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统还包括宿主细胞。

19.根据权利要求17所述的腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体表达系统选自大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统、植物表达系统；优选的，所述腺相关病毒载体表达系统选自质粒瞬时转染表达系统、杆状病毒表达系统、稳转细胞系表达系统、腺病毒表达系统、痘病毒表达系统中的任一种。

20.一种腺相关病毒，其特征在于，所述腺相关病毒由权利要求17-19任一所述的腺相关病毒载体系统包装而成。

21.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系为经权利要求20所述的腺相关病毒感染的细胞系。

22.权利要求20所述的腺相关病毒、权利要求21所述的细胞系在制备预防、治疗遗传性凝血因子缺乏病的产品中的用途。

23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于，所述遗传性凝血因子缺乏病为a型、b型或c型血友病。

24.一种治疗遗传性凝血因子缺乏病的方法，其特征在于，所述方法包括向患者给予有效量的权利要求20所述的腺相关病毒。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述遗传性凝血因子缺乏病为a型、b型或c型血友病。

26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述遗传性凝血因子缺乏病为哺乳动物遗传性凝血因子缺乏病；优选的，所述遗传性凝血因子缺乏病为人遗传性凝血因子缺乏病。

27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，向患者肌肉注射有效量的权利要求20所述的腺相关病毒。

技术总结
本发明涉及基因治疗技术领域，特别是涉及用于遗传性凝血因子缺乏病治疗的核酸构建体及其新用途。所述构建体包括以下元件：编码凝血因子IX的多核苷酸；AAV顺式作用元件，所述AAV顺式作用元件包括ITR、启动子、kozak序列、SV40polyA、UTR或WPRE中的一种或多种。优选的，所述编码凝血因子IX的多核苷酸序列为经过密码子优化的序列，优选的，所述经过密码子优化的多核苷酸序列为包括R338L突变的凝血因子IX的序列。所述新用途为靶向肌肉的AAV载体血清型在制备遗传性凝血因子缺乏病治疗产品中的用途。以该核酸构建体和携带凝血因子目的基因的核酸构建体制备的腺相关病毒在肌肉注射的递送方式下，具有肌肉偏向性，并表达治疗有效剂量的凝血因子。

技术研发人员：吴昊泉,苏玲玲,丁彦甫,傅晓斌
受保护的技术使用者：康霖生物科技（杭州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15