pHLIP-Lamp2b-1/2融合蛋白重组质粒及其构建、应用

本发明涉及生物医药，具体涉及phlip-lamp2b-1/2融合蛋白重组质粒及其构建、应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤是威胁人类健康的的重要因素之一，早期不易诊断且治愈率低，可见有效的临床诊断和治疗对于提高癌症患者的生存率至关重要。靶向肿瘤特异性生物标志物有助于肿瘤的早期精准诊断和药物的有效递送，且对正常细胞的毒副作用较小。然而，由于肿瘤细胞的遗传、表型异质性和受体特异性低，使靶向治疗在临床应用中具有一定的局限性。多项研究发现，不同类型的单克隆抗体、配体蛋白、局限性肽或核酸均可作为肿瘤特异性生物标志物。但仍未确定一种可以适用于各种肿瘤的“通用”生物标志物。由于肿瘤细胞代谢较快、糖酵解增加和碳酸酐酶活性强等导致肿瘤微环境呈酸性状态，是几乎所有肿瘤的普遍特征。利用这一特性可以区分肿瘤和正常组织细胞，细胞表面酸性可以作为肿瘤的通用生物标志性特征。

2、低ph插入肽(ph low insertion peptide，phlip)来源于细菌视紫红质的c-螺旋是一种水溶性分子，以ph依赖性方式与脂质膜相互作用。phlip具有以下三种形态，在正常生理ph(ph7.4)条件下，phlip在水溶性状态(i)和膜表面吸附状态(ii)之间保持平衡；当ph值降低时，phlip中的天冬氨酸或酸性氨基酸残基发生质子化导致phlip的疏水性增强，使phlip自发折叠成α螺旋跨膜结构(iii)。其羧基(c)末端可以快速插入靶细胞的细胞质中，氨基(n)末端在细胞膜外将phlip定位在质膜脂质双分子层上。因此，phlip具有靶向酸性组织和双重递送能力，各种外源性分子可以通过与phlip的n端或者c端偶联，从而将它们靶向递送至细胞表面和细胞内。而phlip递送的细胞中的许多分子可以大概分为：药物剂、细胞渗透性分子和极性细胞不透水性的分子。

3、phlip已经被证明可以靶向肿瘤酸性微环境，其靶向递送系统对比传统的靶向纳米载体和穿膜肽具有特异性强的优势，在应用上phlip具有以下有利条件：phlip对肿瘤细胞中受体或抗原的异质性表达不敏感；phlip具有主动靶向酸性肿瘤微环境的特定标志；phlip不仅可以精准靶向原发肿瘤病灶和转移病灶，还可以利用phlip插入肿瘤细胞膜表面的特性开发其更多方面的应用。phlip技术可以递送不同类型的功能性分子到细胞中用于治疗和诊断，在临床具有较好的应用前景，但目前仍然有不足之处需要优化，其中提高phlip和外源性分子的合成效率可以显著提高其临床转化能力。虽然phlip已被证实对酸性肿瘤微环境有特异性靶向作用，但还需要进一步的提高其靶向的效率，在临床应用时需要筛查患者有无炎症性疾病，从而提高phlip的高特异性。

4、外泌体是由细胞内多泡体和细胞膜融合后，释放到细胞外的一种直径约10-100nm的膜性囊泡，其中包含rna、蛋白质、dna片段等多种胞内物质。外泌体能在细胞间穿梭，有利于细胞间物质与信息的交换，可装载化疗药物及sirna进行靶向治疗。外泌体作为药物载体具有天然的优势：(1)具备纳米级尺寸，在体内很容易逃过网状内皮系统的捕获；(2)具有磷脂双分子层结构，与细胞膜组成相似，对细胞膜具有较强的亲和力，便于进入细胞；(3)属于内源性囊泡，作为载体进入体内不会引起免疫反应，不会被体内的免疫系统鉴定为“非我物质”而吞噬；(4)其来源于细胞，表面含有众多跨膜蛋白，可以通过基因修饰的方式，在适当的蛋白末端加上能够靶向目标细胞的配体短肽，实现体内的靶向治疗。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种philp-lamp2b-1/2融合蛋白重组质粒及其构建方法、应用，本发明成功构建pcdh-phlip-lamp2b1-puro和pcdh-phlip-lamp2b2-puro两种重组质粒，并获得稳定表达酸敏肽融合蛋白hek293t单克隆细胞株hek293tl1/l2，为靶向性外泌体的制备和外泌体的靶向性提供了基础。

2、为实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供了一种philp-lamp2b融合蛋白，所述融合蛋白由philp与外泌体膜蛋白lamp2b融合组成，所述融合蛋白的基因序列如seq id no.1所示，所述融合蛋白命名为philp-lamp2b-1。

4、进一步地，所述融合蛋白是利用重叠延伸pcr技术将lamp2b信号肽-wt-phlip-flag和lamp2b-ha连接为philp-lamp2b-1融合蛋白基因序列，并在其两端添加nhei和bamhi双酶切位点；其中lamp2b信号肽-wt-phlip-flag序列如seq id no.2所示；lamp2b-ha序列如seq id no.3所示。

5、进一步地，所述融合蛋白还包含有具有保护作用的糖基化基序，所述融合蛋白的基因序列如seq id no.4所示，所述融合蛋白命名为philp-lamp2b-2。

6、另一方面，本发明提供了一种philp-lamp2b-1/2融合蛋白重组质粒，所述重组质粒按照以下步骤制备：

7、(1)lamp2b-ha目的基因序列扩增

8、利用pcr扩增技术扩增出除信号肽以外的lamp2b目的基因序列，引物序列如seqid no.7-8；并利用pcr技术在其序列末端添加ha标签序列，获得的lamp2b-ha序列如seq idno.3所示；

9、(2)phlip-flag基因序列扩增

10、利用pcr扩增技术扩增出lamp2b信号肽-wt-phlip-flag标签序列，获得的lamp2b信号肽-wt-phlip-flag序列如seq id no.2所示；

11、(3)构建phlip-lamp2b-1和phlip-lamp2b-2融合蛋白基因

12、利用重叠延伸pcr技术将pcr扩增得到的lamp2b信号肽-wt-phlip-flag酸敏肽序列和lamp2b-ha基因序列连接为融合蛋白phlip-lamp2b-1和phlip-lamp2b-2；

13、(4)构建酸敏融合肽重组质粒

14、将酸敏肽融合基因克隆至pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp-puro慢病毒载体上的多克隆位点，获得重组质粒pcdh-phlip-lamp2b1-puro和重组质粒pcdh-phlip-lamp2b2-puro，分别简称为l1和l2；

15、(5)酸敏融合肽重组质粒鉴定

16、将所构建的重组质粒l1和l2通过限制性核酸内切酶nhei和bamhi进行双酶切试验，经鉴定成功构建酸敏融合肽重组质粒，并分别命名为pcdh-phlip-lamp2b1-puro和pcdh-phlip-lamp2b2-puro。

17、进一步地，将重组质粒l1和l2包装成慢病毒转染hek293t细胞，并收集慢病毒液进行浓缩来感染hek293t细胞；随后使用嘌呤霉素和倍数稀释法相结合来筛选单克隆细胞，获得稳定表达酸敏肽融合蛋白的hek293t单克隆细胞株hek293tl1/l2。

18、有益效果

19、本发明提供了一种philp-lamp2b-1/2融合蛋白重组质粒及其构建方法、应用。本发明利用pcr扩增技术、重叠延伸pcr、转化和连接技术将phlip与外泌体膜蛋白lamp2b融合，获得酸敏融合肽基因序列phlip-lamp2b-1以及添加具有保护作用的糖基化基序(gnstm)位点的酸敏融合肽基因序列phlip-lamp2b-2；利用上述两种酸敏融合肽蛋白构建了重组质粒pcdh-phlip-lamp2b1-puro和pcdh-phlip-lamp2b2-puro(分别简称为l1和l2)，所述质粒可用于细胞转染以及与慢病毒包装质粒共同表达将携带基因包装入慢病毒颗粒，为外源基因稳定插入细胞基因组，获得修饰后受体细胞踪奠定基础。与此同时本发明还获得了能够稳定表达酸敏肽融合蛋白的hek293t单克隆细胞株hek293tl1/l2，为靶向性外泌体的制备和外泌体的靶向性创造了条件。