一种改良的乳铁蛋白基因、重组表达载体及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程和转基因植物领域，具体涉及一种改良的乳铁蛋白基因、表达该乳铁蛋白基因的重组表达载体、该重组表达载体的构建方法及其在生产乳铁蛋白中的应用。

背景技术：

1、乳铁蛋白是广泛分布于具有分泌功能的组织及其分泌物中的蛋白，最早于1939年在牛奶中发现，并于1960年从牛奶和人乳汁中被分离。在人体中，初乳中含量最高，达8mg/ml，在乳汁中为1.5-4mg/ml,在泪液中为2mg/ml，在其他分泌物(如唾液、关节液、血浆)中含量较低，一般低于0.01mg/ml。其被认为与铁转运和储存相关，属于乳转铁蛋白(lactotransferrin)家族。乳铁蛋白序列在人、牛、鼠、猪等物种当中高度保守，为约690个氨基酸残基的糖蛋白，分子量约76-81kda。在三维结构上，乳铁蛋白包含n-和c-两个小叶(lobe)，每个小叶在两个结构域之间的深裂隙中能够结合一个单独的fe3+离子[1]。

2、在消化道中，乳铁蛋白会被水解成为具有生理功能的小肽——乳铁蛋白活性多肽(lfcin b)，它是含有25个氨基酸的多肽，具有强碱性(ph>8.15)，其水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构，具有耐热、在消化道中不易降解、调节免疫活动、广谱抑菌等特性。这也是口服乳铁蛋白发挥活性的基础。迄今为止，乳铁蛋白的研究开发与应用已成为科学研究的重点，现有研究表明，乳铁蛋白具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、免疫调节、促进骨骼生成、调节肠道菌群等活性，其在疾病预防、辅助治疗等方向上得到广泛应用。

3、目前乳铁蛋白的制备主要依赖于从牛奶中提取，例如飞鹤集团应用先进的层析超滤技术,实现了乳铁蛋白的提取，建成了行业内第一条乳铁蛋白自动化生产线。然而从牛奶中提取乳铁蛋白，具有动物病原污染的风险，此外乳铁蛋白的天然含量不足，约14kg牛奶中仅能提取1g蛋白，这都限制了从牛奶中大量制备乳铁蛋白，也使得乳铁蛋白的价格高达7000～8000元/kg。

4、为了大量生产乳铁蛋白，目前，已经有在大肠杆菌、毕赤酵母、小鼠、奶牛、马铃薯和大米中表达乳铁蛋白的成功案例，然而通过原核生物表达的蛋白通常因为缺少翻译后修饰而不具有生物活性。以酵母或动物细胞培养来表达这些蛋白不仅成本高而且条件要求高。

5、植物果实或种子具有较强的蛋白合成功能，若能以转基因植物来表达乳铁蛋白，其产物接近天然即具有较高的生物活性、表达量高、成本低而且简单易行。但是现有技术中很少有人利用植物尤其是大豆来大量生产乳铁蛋白。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，通过利用组成型启动子和组织特异性启动子驱动乳铁蛋白基因表达，以获得更好的表达效果。为此，本发明提供了一种改良的乳铁蛋白基因、重组表达载体及其制备方法、以及在生产乳铁蛋白中的应用。

2、本发明的第一方面提供了一种改良的乳铁蛋白基因。

3、所述乳铁蛋白基因(简称chlf)的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述乳铁蛋白基因编码的乳铁蛋白(简称hlf)氨基酸序列如seq id no:2所示。

4、seq id no:1(chlf核苷酸序列)

5、atgaagctcgtgtttctagtgctgctcttcttaggggcactggggctctgtttagccggaaggagacgcaggtcagtacagtggtgtgctgtctcacaacctgaggctacaaaatgcttccaatggcaaagaaacatgagaaaggtgagaggaccgcccgtatcgtgcataaagcgtgattcaccaatccaatgtattcaggctattgctgaaaacagagcagatgccgtaactcttgacggtggttttatatatgaagcaggcctcgctccatacaagttacgtcctgttgctgctgaggtttatggaaccgagagacagccaaggacacattattatgctgttgcagtagtgaagaagggcgggtctttccagttgaatgaattgcagggattaaaatcttgtcacaccggtttgcgaagaaccgccggatggaatgttccaattggcacgctacgacccttcttaaattggactgggcctcctgagcctattgaggcggccgtggctaggttcttttcagccagttgtgttcctggagctgacaaaggccagtttccaaacctgtgtaggttatgtgctgggactggtgaaaacaaatgtgcattctcttctcaagaaccatatttttcatacagcggtgctttcaagtgcctaagggatggtgcaggtgatgtggcgtttattagagaatctactgtttttgaagacctctccgacgaagctgaacgggacgagtatgagttgctttgtccagataacacaaggaaaccagttgataaatttaaagattgtcaccttgctagggtgccttcccacgccgtcgttgcacggagtgttaatggcaaggaggatgcaatttggaatttattaagacaagcacaagagaagtttggaaaggataaatcccctaagtttcagctcttcggtagccccagtggacagaaagacctactgttcaaagactccgcaatcggattcagccgtgtgcctccacggattgattcagggttgtacttgggttcagggtattttactgctatacaaaatttgaggaagtctgaagaagaggtggccgccagacgtgcaagagttgtttggtgcgccgtgggagagcaggagcttcgaaagtgcaatcagtggagtggattgagcgaaggaagtgtcacttgctccagtgcttctacgacagaagattgcatagctctagttctcaaaggagaagcggatgctatgtctctggatgggggctatgtttacactgcaggaaaatgtggacttgtgccggttttggcagaaaattataagtctcagcaatcgagtgatcctgaccctaactgcgttgatcgccctgtcgagggttacctggcagtagccgtggttcgccggtccgacacctcacttacatggaacagtgttaaaggtaaaaagtcatgtcatactgctgtagatagaacagctggttggaatattccaatgggactcctttttaatcaaacaggtagctgcaagtttgatgaatatttctctcagtcgtgcgctccaggttctgatccacgtagcaatctctgtgcgctttgtatcggagatgagcaaggggaaaataagtgtgtccccaactccaatgaaaggtactatggctacacaggcgcctttaggtgtttggcagagaatgctggggatgttgcgtttgtcaaagacgttacagttcttcaaaacactgatggaaacaacaatgaggcatgggcaaaagatttgaagttggctgattttgctttgctctgcttggacgggaagagaaaacccgtgacagaagcacgttcatgccatctagcaatggctccgaatcatgcagtagtatctaggatggataaagttgagcgtcttaagcaagtgcttcttcatcaacaagctaagttcggcagaaacggatctgactgccctgataagttttgtctctttcaaagtgaaaccaagaatcttttgttcaatgataatactgaatgtttagcgcgcttgcatggcaaaaccacctacgagaaatatcttggaccacaatatgtggcaggtatcacaaacttaaagaaatgctccacttcaccactgcttgaggcttgtgagtttcttagaaaaaaggatgaactttgataa

6、seq id no:2(hlf氨基酸序列)

7、mklvflvllflgalglclagrrrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvrgppvscikrdspiqciqaiaenradavtldggfiyeaglapyklrpvaaevygterqprthyyavavvkkggsfqlnelqglkschtglrrtagwnvpigtlrpflnwtgppepieaavarffsascvpgadkgqfpnlcrlcagtgenkcafssqepyfsysgafkclrdgagdvafirestvfedlsdeaerdeyellcpdntrkpvdkfkdchlarvpshavvarsvngkedaiwnllrqaqekfgkdkspkfqlfgspsgqkdllfkdsaigfsrvppridsglylgsgyftaiqnlrkseeevaarrarvvwcavgeqelrkcnqwsglsegsvtcssasttedcialvlkgeadamsldggyvytagkcglvpvlaenyksqqssdpdpncvdrpvegylavavvrrsdtsltwnsvkgkkschtavdrtagwnipmgllfnqtgsckfdeyfsqscapgsdprsnlcalcigdeqgenkcvpnsneryygytgafrclaenagdvafvkdvtvlqntdgnnneawakdlkladfallcldgkrkpvtearschlamapnhavvsrmdkverlkqvllhqqakfgrngsdcpdkfclfqsetknllfndnteclarlhgkttyekylgpqyvagitnlkkcstsplleaceflrkkdel**

8、具体地，构建所述乳铁蛋白基因所采用的引物，分别为seq id no：9所示的核苷酸序列和seq id no:10所示的核苷酸序列。

9、seq id no:9引物1(chlf-f1)：aaaggagaagcggatgctat

10、seq id no:10引物2(chlf-r1)：gcctcattgttgtttccatc

11、本发明的第二方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体以5’至3’依次包含以下元件：来自花椰菜花叶病毒的启动子p35s、如seq id no:1所示的乳铁蛋白核苷酸序列、胭脂碱合成酶的终止子nos。

12、具体地，所述来自花椰菜花叶病毒的启动子p35s的核苷酸序列如seq id no:5所示；

13、seq id no:5(p35s核苷酸序列)

14、ccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggaca

15、具体地，所述胭脂碱合成酶的终止子nos的核苷酸序列如seq id no:4所示：

16、seq id no:4(tnos核苷酸序列)

17、gatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc

18、本发明的第三方面提供了一种本发明第二方面所述的重组表达载体的构建方法。

19、步骤如下：(1)将本发明第一方面所述的乳铁蛋白核苷酸序列连入克隆载体peasy-t5上，得到重组克隆载体jk01-t；(2)用限制性内切酶ncoi和ecori分别酶切重组克隆载体jk01-t，将切下的乳铁蛋白核苷酸序列片段插入到所述重组克隆载体jk01-t的ncoi和ecori位点之间，构建成重组表达载体jk-pt01；(3)用hindiii和ncoi酶切重组克隆载体jk01ck-t，将切下的p35s启动子序列插入所述重组表达载体jk-pt01，替换掉所述重组表达载体jk-pt01上的pgma1ab1b核苷酸序列，得到重组表达载体jk-pt01ck；所述pgma1ab1b的核苷酸序列如seq id no:3所示。

20、具体地，所述pgma1ab1b核苷酸序列如seq id no:3所示。

21、seq id no:3(pgma1ab1b核苷酸序列)

22、cttggtgatattgatgatgcattggactctgaaaaaggtaacgttcttcacattattaactgattggagtattatttgtcattttggccttgttcttatcgtaatattactgcattgtatctacaagttgcatagcaagtaaatctacaagttgcatagcaagcaataatttactttgtgcagctgttggagaactactctcacattttatctgaccaagtaccccggctctgcgagtcctaaatgtacaaaactcagttgcagggtccacattagaggttaccttgcaaatgtggatagtaccttccttcccttagcacgtgctggagtgagtttatcacgtagctaggtttgtcagattgggcttagagtgatgaacattcaccaatcaccagtttcttgattcaagttgcagagcatggagtgatgaagattgaaccacgcaagggtgactacaagttatatattctacactttttaaaatttagctcataattagttaacaatatatatagtgctatatatttcttctctcaataaacaatgtagtactataatggaataagaaacttgaaatatgtagaacaatatatagctccatcattaagcaagaaaagggttttttgattggacaaaatttaaatatagttcttaacatgctgtttgtcatgttctgttattagaattgaaatttatctcaagatttgtactaaaaaaaaatatgtagattaaattaaactccaattttaattggagaacaatacaaacaacacttaaaacctgtaattaatttttcttctttttaaaagtggttcaacaacacaagcttcaagttttaaaaggaaaaatgtcagccaaaaactttaaataaaatggtaacaaggaaattattcaaaaattacaaacctcgtcaaaataggaaagaaaaaaagtttagggatttagaaaaaacatcaatctagttccaccttattttatagagagaagaaactaatatataagaactaaaaaacagaagaatagaaaaaaaaagtattgacaggaaagaaaaagtagctgtatgcttataagtactttgaggatttgaattctctcttataaaacacaaacacaatttttagattttatttaaataatcatcaatccgattataattatttatatatttttctattttcaaagaagtaaatcatgagcttttccaactcaacatctattttttttctctcaacctttttcacatcttaagtagtctcaccctttatatatataacttatttcttaccttttacattatgtaacttttatcaccaaaaccaacaactttaaaattttattaaatagactccacaagtaacttgacactcttacattcatcgacattaacttttatctgttttataaatattattgtgatataatttaatcaaaataaccacaaactttcataaaaggttcttattaagcatggcatttaataagcaaaaacaactcaatcactttcatataggaggtagcctaagtacgtactcaaaatgccaacaaataaaaaaaaagttgctttaataatgccaaaacaaattaataaaacacttacaacaccggattttttttaattaaaatgtgccatttaggataaatagttaatatttttaataattatttaaaaagccgtatctactaaaatgatttttatttggttgaaaatattaatatgtttaaatcaacacaatctatcaaaattaaactaaaaaaaaaataagtgtacgtggttaacattagtacagtaatataagaggaaaatgagaaattaagaaattgaaagcgagtctaatttttaaattatgaacctgcatatataaaaggaaagaaagaatccaggaagaaaagaaatgaaaccatgcatggtcccctcgtcatcacgagtttctgccatttgcaatagaaacactgaaacacctttctctttgtcacttaattgagatgccgaagccacctcacaccatgaacttcatgaggtgtagcacccaaggcttccatagccatgcatactgaagaatgtctcaagctcagcaccctacttctgtgacgtgtccctcattcaccttcctctcttccctataaataaccacgcctcaggttctccgcttcacaactcaaacattctctccattggtccttaaacactcatcagtcatcacc

23、本发明的第四方面提供了本发明第一方面所述的乳铁蛋白基因、本发明第二方面所述的重组表达载体在生产乳铁蛋白中的应用。

24、具体地，所述应用包括步骤：(1)将本发明第二方面所述的重组表达载体利用农杆菌介导法转化大豆的外植体，获得基因组中整合有本发明第一方面所述的乳铁蛋白基因的外植体；(2)将步骤(1)中所获得的外植体进行分化培养，获得再生植株筛选出表达权利要求1所述的乳铁蛋白基因的转基因大豆植株；(3)所获得的转基因大豆植株因其种子中含有表达的乳铁蛋白而具有附加营养价值，可以直接食用或加工成其它营养食品或作为其它食品的添加原料使用。

25、更具体地，所述外植体为大豆幼苗的下胚轴。

26、更具体地，所述分化培养包括丛生芽分化、伸长芽分化、生根分化。