一种菌种保存方法与流程

本发明涉及一种菌种保存方法，适用于真空冷冻干燥管中的冻干菌粉打开使用后的剩余菌粉的保存，属于生物。

背景技术：

1、传统菌种保存方法大致可分为传代培养保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、寄主保藏法、冷冻保藏法和冷冻干燥保藏法六种。实验室保存菌种以冷冻保存法为主，该方法存在操作简单且保存周期长的特点。

2、目前，实验室从菌种保藏中心购买的菌种多以冷冻干燥保存法为主，即菌体是以高浓度的冻干菌粉的状态存在。然而，实验室在使用购买的冻干状态的菌株的过程中，往往需要冻干粉首先经平板分离纯化，然后进行传代培养，制成液体工作种子后再进行菌种的保存和使用。上述保存和使用过程中存在两方面问题：一方面，真空冷冻干燥管中的冻干菌粉一经打开使用后会有大量剩余，存在无法保存、扔掉浪费可惜的问题；另一方面，有些工作菌株在使用过程中可能存在经传代后出现菌种性状丢失的现象，导致无法从菌种冻干粉中重新获得目标菌株。因此，如何进行菌种的有效保存，避免已开启的真空冷冻干燥管中剩余冻干菌粉的损失和浪费是当前亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种菌种保存方法，适用于真空冷冻干燥管中的冻干菌粉打开使用后的剩余菌粉的保存。本发明首先将剩余菌粉与灭菌的盐溶液混匀制成菌悬液，然后在适当条件下孵育；将孵育完成的菌悬液与菌种保护剂充分混匀；混匀后的菌体混悬液进行冻存管分装，置于-70℃～-85℃下超低温保存。该方法不仅稳定了菌种的性状，使其不易发生变异，而且冻干粉的再保存方法操作简单、重复性好，从而避免了“已开启的真空冷冻干燥管中冻干菌粉的损失和浪费”。

2、本发明所提出的技术方案为：一种菌种保存方法，其特征是，适用于真空冷冻干燥管中的冻干菌粉打开使用后的剩余菌粉的保存；其保存方法包括如下步骤：

3、(1)将剩余菌粉与灭菌的盐溶液混匀制成菌悬液；

4、(2)将步骤(1)的菌悬液在25～37℃下孵育0.5～1.0h；

5、(3)将孵育完成的菌悬液与菌种保护剂充分混匀；

6、(4)将步骤(3)混匀后的菌体混悬液进行冻存管分装；然后将冻存管置于-70℃～-85℃下超低温保存。

7、冻存管开启后一般先吸取0.9wt％nacl灭菌生理盐水混匀得到菌液；然后吸取部分菌液进行稀释涂布使用，剩余菌液离心后进行保存。本发明所说的剩余菌粉是指菌液离心后重新获得的菌粉。

8、进一步的，所述盐溶液组成为(质量比)：k2hpo4·3h2o 0.8％～1.0％，kh2po40.1％～0.3％，na2hpo4·12h2o 1.0％～1.2％，mgso4·7h2o 0.02％～0.03％，其余为水。

9、进一步的，所述的菌种保护剂为质量分数为30％～50％的灭菌甘油与过滤除菌的质量分数为0.3％～0.6％的维生素c水溶液；二者的体积比为5～50：1。所述无菌盐溶液和菌种保护剂的体积比为1：0.8～1.2，优选1：1。

10、优选的，步骤(1)中菌悬液的浓度为0.5*107～5*107cfu/ml，优选1*107cfu/ml。

11、优选的，步骤(2)中菌悬液的孵育为摇床孵育，摇床转速为50～100rpm。

12、优选的，步骤(3)中冻存管体积为1～5ml。

13、本发明精心配制了孵育盐溶液，盐溶液中添加的钾盐与钠盐可维持细胞渗透压、细胞透性和ph，镁盐作为许多重要酶的激活剂，可维持细胞活性；上述盐溶液，可使菌体在保存过程中基本不进行繁殖，保持低代谢状态。菌种保护剂中甘油有防冻及保湿作用，对微生物起到保护作用；添加维生素c使菌种保存处于氧气低浓度状态，避免自由基对细胞的损伤。

14、本发明的菌种保存方法，具有以下优点：一是该方法获得的冻干粉甘油管可作为主菌种进行保存，也可活化后作为工作种子使用；二是采用该保存方法，可以避免已开启的真空冷冻干燥管中冻干菌粉的损失和浪费；三是对剩余冻干粉的再保存，可以防止在菌体传代过程中性状丢失，为保存菌体性状多一层保障；四是孵育基质为盐溶液，没有培养基的加入，避免了菌种在保存期内存在生长的营养条件，稳定了菌种的性状。五是菌种保护剂中添加维生素c使菌种保存处于氧气低浓度状态。总之，该方法不仅稳定了菌种的性状，使其不易发生变异，而且冻干粉的再保存方法操作简单、重复性好；有利于提高生产效率和冻干粉质量。

技术特征：

1.一种菌种保存方法，其特征是，适用于真空冷冻干燥管中的冻干菌粉打开使用后的剩余菌粉的保存；其保存方法包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的菌种保存方法，其特征是，所述盐溶液组成为，按质量比计：k2hpo4·3h2o 0.8％～1.0％，kh2po4 0.1％～0.3％，na2hpo4·12h2o 1.0％～1.2％，mgso4·7h2o 0.02％～0.03％，其余为水。

3.如权利要求1所述的菌种保存方法，其特征是，所述的菌种保护剂为质量分数为30％～50％的灭菌甘油与过滤除菌的质量分数为0.3％～0.6％的维生素c水溶液；二者的体积比为5～50：1。

4.如权利要求1所述的菌种保存方法，其特征是，所述无菌盐溶液和菌种保护剂的体积比为1：0.8～1.2。

5.如权利要求4所述的菌种保存方法，其特征是，所述无菌盐溶液和菌种保护剂的体积比为1：1。

6.如权利要求1所述的菌种保存方法，其特征是，所述步骤(1)中菌悬液的浓度为0.5*107～5*107cfu/ml。

7.如权利要求1所述的菌种保存方法，其特征是，所述步骤(2)中菌悬液的孵育为摇床孵育，摇床转速为50～100rpm。

8.如权利要求1-7中任一项所述的菌种保存方法，其特征是，所述步骤(3)中冻存管体积为1～5ml。

技术总结
本发明公开了一种菌种保存方法，适用于真空冷冻干燥管中的冻干菌粉打开使用后的剩余菌粉的保存。本发明首先将剩余菌粉与灭菌的盐溶液混匀制成菌悬液，然后在适当条件下孵育；将孵育完成的菌悬液与菌种保护剂充分混匀；混匀后的菌体混悬液进行冻存管分装，置于‑70℃～‑85℃下超低温保存。采用该保存方法，可以避免已开启的真空冷冻干燥管中冻干菌粉的损失和浪费；对剩余冻干粉的再保存，也可以防止在菌体传代过程中性状丢失，为保存菌体性状多一层保障。

技术研发人员：刘灿珍,刘鹏,张文丽,陈启鹏,黄炳亥
受保护的技术使用者：广西天铭药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13