用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组的制作方法

本发明涉及生物医药，具体为用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组。

背景技术：

1、干细胞是一类具有自我更新复制、高度增殖和多向分化潜能并保持未分化状态的细胞。间充质干细胞（mesenchyma stem cell，mscs）是干细胞家族的重要成员，来源于中胚层的成体干细胞。由于其具有自我更新能力、多向分化潜能、低免疫原性和来源广泛等特点，已应用于越来越多的实验研究和临床治疗当中，成为现阶段临床治疗研究中发展最为迅速的一类干细胞。

2、干细胞组织工程已经成为最有影响力及最有应用前景的生命科学研究领域，而干细胞的生物学有效性质量属性评价是产品研发、临床研究的重要环节。人源间充质干细胞（human mesenchyma stem cell，hmscs）是一类具有一定程度的自我更新、多谱系细胞分化、免疫调控和促进组织再生功能等生物学有效性质量属性的成体干细胞，hmscs生物学有效性质量评价的核心内容是体外评价hmscs向不同细胞谱系分化的能力。目前普遍接受2006年isct）首次提出的以成骨、成脂和成软骨细胞诱导分化能力的评价方法。

3、目前，hmscs向诱导成脂结果鉴定常用油红o染色法，其为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。染色法具有操作简便，耗时较短，能直观反映检测结果的优点，但该方法在一些未经诱导分化的细胞或无成脂肪分化能力的细胞中表现为阳性。此外，染色法还有灵敏度低、定量范围较窄、手动操作时间较长等缺点。

4、据文献报道，可利用脂肪细胞特定基因表达，通过该基因转录的mrna的多少来衡量的该基因表达水平，从而达到细胞分化能力鉴定的目的，可将此特定基因作为hmscs向脂肪细胞分化的一个分子标志物。lpl基因编码脂蛋白脂肪酶，是参与脂质代谢的酶。在脂肪细胞形成和脂肪代谢中，一系列的mrna通过靶基因作用参与了hmscs的成脂分化过程；可通过检测lpl基因的表达水平来检测hmscs向脂肪细胞能力。荧光定量pcr技术是定量分析mrna的最通用、最快速、最简便的方法，该方法通过荧光强度变化实时监测产物量的变化，具有很高的灵敏性和特异性，但此种方式目前还在初步应用阶段，还不够全面，难以有一个完整流程针对人源间充质干细胞分化诱导成脂肪细胞潜能进行检测。

技术实现思路

1、解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组，解决了现有的hmscs向诱导成脂结果鉴定常用油红o染色法具有灵敏度低、定量范围较窄、手动操作时间较长的缺点，但利用脂肪细胞特定基因表达虽然灵敏性高但不够全面，难以有一个完整流程针对人源间充质干细胞分化诱导成脂肪细胞潜能进行检测的问题。

3、技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组，包括正向扩增引物、反向扩增引物和内参基因gapdh的引物序列；

5、所述设计引物序列为：

6、seq id为no:1，目标基因为lpl，参考序列为nm_001632.5，序列(5’→3’)为f:taaaagggtggagaggttcctgggg，片段长度为92；

7、seq id为no:2，目标基因为lpl，参考序列为nm_001632.5，序列(5’→3’)为r:gcaaccctcatggtactccatctggc，片段长度为92；

8、seq id为no:3，目标基因为gapdh，参考序列为nm_002046.7，序列(5’→3’)为f:gccatcactgccacccagaagac，片段长度为179；

9、seq id为no:4，目标基因为gapdh，参考序列为nm_002046.7，序列(5’→3’)为r:acgttggcagtggggacacggaa，片段长度为179。

10、优选的，所述正向扩增引物包括其核苷酸序列；

11、用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组的pcr反应，所述pcr反应包括pcr反应液，所述反应液包括dntp、荧光染料和taq聚合酶；

12、用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组的定量检测方法，具体包括以下步骤：

13、s1.人源间充质干细胞的培养及成脂分化诱导

14、培养人源间充质干细胞至80-90%融合，分别设置成脂对照组和实验组，并选用相应培养基进行培养、染色鉴定诱导结果；

15、s2.待检hmscs样本的总rna提取

16、待培养及鉴定结束，采用rnaprep pure培养细胞/细菌总rna提取试剂盒相关提取步骤进行总rna提取；

17、s3.rna逆转录

18、根据相关操作规范，使用上述所提rna进行反转录；

19、s4.real-time pcr反应

20、使用脂肪细胞分化相关基因lpl的引物片段结合superreal premix plus试剂盒方法进行混合体系配置、加样、设置并运行扩增程序；

21、s5.结果分析

22、根据荧光定量pcr反应数据，利用2–δδct法计算相对定量结果；

23、一种定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的lpl基因引物组的应用,包括所述引物组在荧光定量pcr检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的分化潜能的试剂盒中的应用。

24、有益效果

25、本发明提供了用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组。具备以下有益效果：

26、本发明提供了用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组，本发明具有灵敏度高，特应性高，应用场景可量化可统计的优点，灵敏度：使用实时荧光定量pcr技术，通过荧光强度变化实时监测产物量的变化，从分子层面对hmscs成脂分化能力鉴定提供了特定标记物进行检测，具有很高的灵敏性；特异性：对成脂分化特定基因产物进行扩增，避免染色法造成的假阳性结果，评价hmscs诱导分化成脂肪细胞的能力具有高度特异性；应用场景：现有技术手段针对间充质干细胞的生物有效性检测中的分化能力检测，多用诱导分化后的染色法进行结果判定，该方法虽有较直观的视觉图像呈现，但也有明显的缺点：假阳性、假阴性常见，显色灵敏度不够，也因观察方法为显微镜下观察法，视觉区域较微观，结果判定和观察时显微镜视野区域选择与变化关系巨大，而本专利涉及的引物如应用到干细胞诱导分化后的检测实验中，可以直接的避免上述弊端，得到可量化、可统计的数据结论。

技术特征：

1.用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组，其特征在于：包括正向扩增引物、反向扩增引物和内参基因gapdh的引物序列；

2.根据权利要求1所述的用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组，其特征在于：所述正向扩增引物包括其核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组的pcr反应，其特征在于：所述pcr反应包括pcr反应液，所述反应液包括dntp、荧光染料和taq聚合酶。

4.根据权利要求1所述的用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组的定量检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的一种定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的lpl基因引物组的应用，其特征在于：包括所述引物组在荧光定量pcr检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的分化潜能的试剂盒中的应用。

技术总结
本发明提供用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组；用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组，包括正向扩增引物、反向扩增引物和内参基因GAPDH的引物序列；还提供用于定量检测干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的引物组包括正向扩增物和反向扩增物，其核苷酸序列表SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，为了检测的稳定性，还提供了内参基因正向引物和反向引物，其核苷酸序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示，该引物可用于荧光定量PCR检测人源间充质干细胞分化诱导成脂肪细胞的潜能，为安全性评价提供了可靠的PCR引物，检测结果特异性强，灵敏度高，结果判断准确客观。

技术研发人员：陈曦,张瑞丽,钱云,莫春红,李春春,闫姗姗,李兵,杨瑜,姜小锋
受保护的技术使用者：云南舜喜再生医学工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12