一种高RNA含量的杰丁塞伯林德纳氏酵母菌株及其应用

本发明属于微生物，具体地，涉及一种高rna含量的杰丁塞伯林德纳氏酵母菌株及其应用。

背景技术：

1、核糖核酸（ribonucleic acid，rna）是一类对于生物体极其重要的大分子物质，参与基因表达，在蛋白质的合成过程中有很重要的作用。rna的水解以及衍生物用途广泛，其中5’-肌苷酸（5’-imp）和5’-鸟苷酸（5’-gmp）及其二钠盐，可以作为食品添加剂应用到食品工业中，增加食品的鲜味；rna降解产生的核苷酸、核苷和碱基可以作为重要的医药前体，其衍生物在抗击肿瘤和病毒方面有着显著的作用；在食品中添加rna还可以延缓衰老，有助于人体增强抵抗力。

2、目前，工业生产中通常利用酵母发酵来生产rna，酵母细胞rna含量占菌体干重的14%-15%，并且美国食品和药物管理局（fda）认证产朊假丝酵母 candida utilis为gras（generally recognized as safe）微生物，能够用于食品生产。基因组测序结果表明，杰丁塞伯林德纳氏酵母 cyberlindnera jadinii与 c. utilis二者基因组在序列水平上高度相似，总体序列同源性为98%， c. jadinii被认为是 c.utilis的有性生殖状态，后来将名称统一为杰丁塞伯林德纳氏酵母 c. jadinii。 c. jadinii富含蛋白质、氨基酸和核糖核酸，能够用于生产乳酸、莫内林、葡甘露聚糖和生物素等多种生物制品。 c. jadinii具有以下特点：发酵密度高；对外界环境有较高的耐受性；具有crabtree-negative效应，严格好氧条件下不产生乙醇；能够在19~37℃的广谱温度下生长；可以利用廉价的糖蜜和工业废水进行生长；能够利用尿素、硝酸盐和铵盐。 c. jadinii因具有这些优良特性，因此在工业生产中具有很大优势。

3、选育高rna酵母菌株在工业生产中具有很大的作用。一般采用物理或化学诱变对菌株进行处理，对诱变菌株进行选育，筛选高产菌株。常压室温等离子体诱变（atmosphericroom temperature plasma，artp）作为一种新型诱变策略，通过正常大气压下产生的高活性粒子对细胞造成损伤，诱发细胞启动sos修复机制，引起微生物发生突变，产生遗传稳定的突变株。artp诱变成本低、操作简便、安全性高，对dna的损伤程度大于传统的诱变方法已经成功地应用到了细菌、真菌、放线菌以及微藻等。早期对诱变后的菌落进行筛选主要是通过在平板上随机挑选，然后在摇瓶中进行发酵并测定结果，耗时耗力，成本较高。目前可以通过高通量筛选技术进行快速筛选，在深孔板中对大多数微生物进行培养或反应，并结合酶标仪可以实现在短时间内对大量的微生物进行快速筛选的目的，大大提高了诱变后筛选突变株的效率。然而，目前高rna含量的酵母菌菌株资源仍然十分匮乏。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，以 cyberlindnera jadinii mt1903为出发菌株，对其进行artp诱变得到突变株，然后在48孔深孔板和摇瓶中进行培养，最终成功筛选得到了高rna含量的酵母菌株，从而完成本发明。

2、本发明第一方面提供一种高rna含量的杰丁塞伯林德纳氏酵母菌株，命名为 cyberlindnera jadinii wb15菌株，于2023年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2023385；保藏地址为：中国·武汉·武汉大学。

3、本发明第二方面提供一种发酵液，包括本发明第一方面所述的 cyberlindnera  jadinii wb15菌株的活性菌或死亡菌体。

4、在本发明的一些实施例中，所述发酵液为利用所述 cyberlindnera jadinii wb15菌株进行发酵得到的。进一步地，发酵液经过处理，使得菌体死亡，此时的发酵液同样落入本发明的保护范围。

5、本发明第三方面提供本发明第二方面所述的发酵液在制备rna产品中的应用。所述rna产品包括rna本身及其水解和衍生物，包括但不限于5’-肌苷酸（5’-imp）和5’-鸟苷酸（5’-gmp）及其二钠盐，rna降解产生的核苷酸、核苷和碱基。

6、本发明第四方面提供一种用于培养本发明第一方面所述的 cyberlindnera  jadinii wb15菌株的培养基组合，包括用于菌株活化的种子培养基和/或用于菌株发酵的发酵培养基。

7、在本发明的一些实施方案中，所述种子培养基的组成为：葡萄糖40g/l，玉米浆12~18g/l，kh2po42.0~2.5g/l，mgso4 2.0~3.0g/l，ph 6~7。

8、在本发明的一些优选实施方案中，所述种子培养基的组成为：葡萄糖40g/l，玉米浆15g/l，kh2po42.3g/l，mgso42.5g/l，ph 6.5。

9、在本发明的一些实施方案中，所述发酵培养基组成为：蔗糖50g/l，酵母抽提物8~15g/l，大豆蛋白胨8~15g/l，kh2po41.8~2.9g/l，mgso4 2.0~3.0g/l，feso40.005~0.02g/l，znso40.005~0.02g/l，ph 5~6。

10、在本发明的一些优选实施方案中，所述发酵培养基组成为：蔗糖50g/l，酵母抽提物10g/l，大豆蛋白胨10g/l，kh2po42.3g/l，mgso42.5g/l，feso40.01g/l，znso40.01g/l，ph5.5。

11、在本发明的另一些优选实施方案中，所述发酵培养基组成为：蔗糖50g/l，酵母抽提物13.4g/l，大豆蛋白胨12.1g/l，kh2po42.8g/l，mgso42.5g/l，feso40.01g/l，znso40.01g/l，ph 5.5。

12、本发明第五方面提供本发明第一方面所述的 cyberlindnera jadinii wb15菌株的发酵方法，包括以下步骤：

13、s1，将斜面保存的所述 cyberlindnera jadinii wb15菌株接种至装有种子培养基的摇瓶中，在温度为28~35℃、摇床转速为200~250rpm下培养16~24h，得到种子液；

14、s2，将种子液按照1~5%的接种量，接种至装有发酵培养基的摇瓶中，在温度为28~35℃、摇床转速为200~250rpm下培养6~10h，

15、其中，所述种子培养基的组成为：葡萄糖40g/l，玉米浆12~18g/l，kh2po42.0~2.5g/l，mgso4 2.0~3.0g/l，ph 6~7；在本发明的一些优选实施方案中，所述种子培养基的组成为：葡萄糖40g/l，玉米浆15g/l，kh2po42.3g/l，mgso42.5g/l，ph 6.5。

16、所述发酵培养基组成为：蔗糖50g/l，酵母抽提物8~15g/l，大豆蛋白胨8~15g/l，kh2po41.8~2.9g/l，mgso42.0~3.0g/l，feso40.005~0.02g/l，znso40.005~0.02g/l，ph 5~6。在本发明的一些优选实施方案中，所述发酵培养基组成为：蔗糖50g/l，酵母抽提物10g/l，大豆蛋白胨10g/l，kh2po42.3g/l，mgso42.5g/l，feso40.01g/l，znso40.01g/l，ph 5.5。在本发明的另一些优选实施方案中，所述发酵培养基组成为：蔗糖50g/l，酵母抽提物13.4g/l，大豆蛋白胨12.1g/l，kh2po42.8g/l，mgso42.5g/l，feso40.01g/l，znso40.01g/l，ph 5.5。

17、在本发明的一些实施方案中，步骤s1中的摇瓶的体积为250ml，其中装有所述种子培养基的体积为25ml。

18、在本发明的一些实施方案中，步骤s1中的摇瓶的体积为250ml，其中装有所述发酵培养基的体积为50ml。

19、本发明还提供一种基于吸光值测定菌株rna含量的方法：

20、将培养好的菌液震荡均匀后取300μl加入到孔板或1.5ml ep管中，在4000r/min下离心10min，弃上清，用0.9% nacl溶液洗涤两遍，加800μl 4℃的0.25mol/l hclo4进行重悬，振荡均匀，在4℃下保温15min，期间不要震荡。在4000r/min离心10min，倒掉上清，再加入800μl的0.5mol/l hclo4，75℃水浴保温15min，期间每隔4min进行振荡混匀。水浴结束后，4000r/min离心10min，取上清分别用酶标仪或紫外-可见光分光光度计进行od260的测定。

21、在摇瓶培养的细胞，发酵结束后测定发酵液od600，然后根据下述公式（2）（3）得出菌株rna含量。

22、rna含量（mg/g dcw）＝(a×d×0.03365×0.8)/（m×0.3）      （2）

23、m=0.4333×od600+0.9011                                （3）

24、其中，公式（2）中：a为样品上清液od260；d为稀释倍数；m为菌体干重（g/l）；0.8为加入0.5mol/l hclo4溶液的体积（ml）；0.3为吸取发酵液的体积（ml）；0.03365为对应于吸光度为1.00时，待测溶液中rna的含量（mg/1ml）。

25、公式（3）为细胞干重与发酵液od600之间回归方程。

26、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

27、本发明以 cyberlindnera jadinii mt1903为出发菌株，对其进行artp诱变得到突变株，然后在48孔深孔板中进行培养，最终筛选得到的高rna含量的 cyberlindnera  jadinii wb15菌株。

28、本发明的 cyberlindnera jadinii wb15菌株具有非常高的传代稳定性，在斜面上传10代，rna含量稳定在156~162mg/g dcw之间，经单因素方差分析，十代之间产量无显著差异。

29、本发明通过对发酵培养基进行优化，进一步提高了 cyberlindnera jadinii wb15菌株的rna含量，可高达为184mg/g dcw。