11dhTxB2单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种11dhtxb2单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病是由于长期动脉粥样硬化引起血小板功能异常，最终引起血栓或出血形式而发病，抗血小板药物是目前临床对血栓性疾病有效预防和治疗的主要措施。

2、阿司匹林(aspirin)，又名乙酰水杨酸，是一种有机化合物，化学式为c9h8o4，为白色结晶性粉末，溶于乙醇、乙醚，微溶于水，主要用作解热镇痛、非甾体抗炎药，抗血小板聚集药。阿司匹林是一种有效的血小板抑制剂，可抑制血栓素a2(txa2)的合成，具有显著抑制血小板的粘附、聚集和释放的作用，从而可防止微血栓形成，防止粥样硬化和心肌梗死。已有研究证实，阿司匹林可显著降低心肌梗死的早期病死率及再梗死率。但近几年的研究显示并非所有的个体对于阿司匹林的反应都是一致的。大约30％的个体服药者对阿司匹林耐药，也就是常说的不起作用，因此监控阿司匹林疗效变得更加关键和重要。

3、11-脱氢血栓素b2(11-dehydro-thromboxaneb2，11-dh-txb2)是血栓烷素a2(thromboxanea2，txa2)的终末代谢产物，主要经肾排出，在止血及心血管疾病的发生过程中均起到重要作用。花生四烯酸在前列腺素h合成酶1和2(cox-1和cox-2)的作用下生成前列腺素h。前列腺素h化学性质不稳定，可在异构酶的作用下转化为多种具有生物活性的前列腺素类物质，包括txa2、前列环素i2、前列腺素d2、前列腺素e2及前列腺素f2α等。txa2主要经cox-1途径在血小板中合成，新生的血小板同时表达cox-1和cox-2，而成熟血小板仅表达cox-1，cox-2则主要表达于单核细胞、内皮细胞等有核细胞中。txa2有强烈的缩血管作用，还可通过结合血栓烷素血小板受体(thromboxaneplateletreceptor，tpr)激活血小板，促进其聚集，从而发挥促血栓形成作用。除txa2外，凝血酶、胶原和腺苷二磷酸(adenosinediphosphate，adp)亦能通过其他通路激活血小板。txa2高度不稳定，会迅速被水解为较稳定的血栓烷素b2(thromboxaneb2，txb2)。txb2随后在肝中被转化为半衰期更长的11dhtxb2，并经尿液排出。txa2则是花生四烯酸在环氧合酶(cyclooxygenase，cox)作用下产生的具有促血小板聚集、收缩血管等生物活性作用的物质，在血栓形成过程中有重要作用。阿司匹林能通过不可逆地抑制cox-1活性，减少txa2合成，从而抑制血小板聚集及其在冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)发展和急性冠状动脉综合征(acutecoronarysyndrome，acs)发生中的作用。

4、直接测定患者对阿司匹林的反应是指测定txa2的循环水平，但txa2的生物半衰期约为30秒，这样分析txa2就非常困难，但是它会在酶的作用下分解成得11-脱氢血栓烷b2(11dhtxb2)被肾脏吸收，排泄在尿液里。11dhtxb2在尿液中非常稳定，它是一种生物非活性物质，是txa2的下游代谢产物，其半衰期较长，不受体内血小板活性和其他分析变量的影响。有专家指出，检测尿中11dhtxb2水平可以更直接地反应阿司匹林对血小板聚集的抑制作用，检测无创，操作简单，耗费人力物力少，分析变异度小，使该方法优于其他的功能检测。目前有研究证实尿中11dhtxb2水平与阿司匹林低反应性及患者心血管事件的发生存在显著的相关关系，可用于评估阿司匹林的临床疗效。因此得到分泌高特异性和高灵敏度的11dhtxb2单克隆抗体的杂交瘤细胞株是应用于11dhtxb2免疫学检测的重要前提。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种抗血栓素代谢物11dhtxb2杂交瘤细胞株，该抗血栓素代谢物11dhtxb2命名为杂交瘤细胞株nat01，保藏号为cgmcc no.45457。该杂交瘤细胞株能够产生高特异性的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体，生产效率高。分泌的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体具有较高特异性、灵敏度和交叉反应率低。本发明提供的单克隆抗体可用于血栓素代谢物11dhtxb2免疫学检测方法的建立。

2、一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株的保藏号为cgmcc no.45457。

3、具体地，所述的杂交瘤细胞株分泌抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体。

4、具体地，所述的杂交瘤细胞株的制备方法包括将动物的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合；筛选阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，获得杂交瘤细胞株。

5、所述的免疫动物可以是小鼠，优选为雌性balb/c小鼠。

6、所述的脾细胞与骨髓瘤细胞融合比例为5:1。

7、所述的亚克隆次数为2-5次，优选为3次。

8、另一方面，本发明提供了一种抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体，所述的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体是由保藏号为cgmcc no.45457的杂交瘤细胞株产生。

9、另一方面，本发明提供了一种制备前述的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体的方法，包括培养前述的杂交瘤细胞株。

10、具体地，所述的方法包括以下步骤：

11、(1)将利要求1所述的杂交瘤细胞株注射至动物腹腔，培养7-10天，回收腹水；

12、(2)沉淀法结合亲和纯化法获得抗体洗脱液；

13、(3)将蛋白沉淀溶于缓冲液，4℃环境下缓冲液透析过夜；

14、(4)回收透析产物即得抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体。

15、进一步具体地，所述的动物是经产鼠。

16、所述的沉淀法可以是硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法、和聚乙二醇(peg)沉淀法的一种或多种。

17、优选地，所述的沉淀法是辛酸-硫酸铵沉淀法。

18、所述的亲和纯化法可以是g蛋白亲和纯化。

19、所述的缓冲液可以是pbs缓冲液、ten缓冲液和tbs缓冲液。

20、优选地，所述的缓冲液是磷酸盐缓冲液。

21、又一方面，本发明提供了前述的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体在制备评估阿司匹林作为血小板抑制剂的试剂或试剂盒中的应用。

22、又一方面，本发明提供了一种评估血小板抑制剂的试剂盒，所述的试剂盒包括前述的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体。

23、具体地，所述的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体的浓度为25-50ng/ml。

24、优选地，所述的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体的浓度为25ng/ml。

25、具体地，所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、标准品、酶结合物、检测抗体和洗涤液。

26、所述的酶标板可以包被羊抗鼠igg。

27、所述的样品稀释液可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；其ph9.0。

28、所述的洗涤液可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；该洗涤液中还含有0.03-0.07％tween-20v/v。

29、优选地，所述的洗涤液中含有0.05％tween-20v/v。

30、具体地，所述的试剂盒还可以包括底物、终止液和封口膜。

31、本发明所取得的的技术效果：本发明提供的杂交瘤细胞株能够产生高特异性的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体，生产效率高。分泌的抗血栓素代谢物11dhtxb2单克隆抗体具有较高特异性、灵敏度和交叉反应率低。本发明提供的单克隆抗体可用于血栓素代谢物11dhtxb2免疫学检测方法的建立。

32、保藏说明：

33、杂交瘤细胞株nat01已于2023年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.45457，分类命名为小鼠杂交瘤细胞。