一种快速检测耐药鲍曼不动杆菌OXA基因核酸胶体金试纸条的方法

本发明涉及分子生物学技术及免疫学技术在微生物鉴定领域的应用，更具体地说，是一种基于分子生物学技术及免疫学技术快速鉴定鲍曼不动杆菌 oxa基因的检测方法。

背景技术：

1、鲍曼不动杆菌是不动杆菌属中最常见的一种非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然环境中，属于机会性致病菌。同时该菌是引起医院感染的一种重要病原微生物。在医院环境中分布甚广且能在体外长期存活，该菌主要引起呼吸道感染，也可引起菌血症、尿路感染等。据研究发现，鲍曼不动杆菌主要发生在医院icu、呼吸内科患者及长期住院的重症老年人。由于该类患者易患重症疾病从而导致免疫力低下，是院内鲍曼不动杆菌感染的易感人群；同时由于进行侵入性治疗导致伤口创面暴露，故极可能发生继发感染。若没有及时发现和治疗，会加剧细菌耐药性，造成多重耐药菌株的爆发，甚至严重者危及生命。

2、根据中国chinet细菌耐药检测网数据显示，鲍曼不动杆菌对第三代和第四代头孢菌素等抗菌药物产生高耐药水平。作为革兰阴性杆菌抗感染治疗的最后一道防线——碳青霉烯类抗菌药物，由于临床使用量和强度的增加，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的耐药率也呈现明显的上升趋势，尤其是对d类碳青霉烯酶（苯唑西林β内酰胺酶， oxa）耐药。据研究报道显示，在临床医院中鲍曼不动杆菌对oxa-23与oxa-51两种耐药基因的耐药率较高。

3、目前对于鲍曼不动杆菌耐药性检测的方法主要包括最小抑菌浓度、表型检测及基因检测。其中mic是鲍曼不动杆菌耐药性检测的“金标准”，但该方法存在一定的局限性，需基于细菌培养，故时效性较长，一般需要3~5天，难以满足临床重症感染患者抗感染治疗快速检测的需求。因此，亟需建立一种快速有效、高灵敏度、强特异性的检测方法。本发明以鲍曼不动杆菌耐药基因 oxa引物进行标记，运用pcr快速扩增技术与胶体金免疫层析试纸条技术相结合，建立一种特异性高、敏感性好、操作简便、快速、可视化的检测方法，为呼吸道鲍曼不动杆菌感染的早期快速诊断、指导临床用药提供理论与实践基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是基于鲍曼不动杆菌 oxa基因片段具有高度的保守性，使用dnaman对鲍曼不动杆菌 oxa基因片段进行分析，设计鲍曼不动杆菌特异性引物并分别在5' 端用生物素（biotin）、荧光素（fitc）进行修饰标记，普通pcr扩增后的产物无需纯化，将pcr产物与样品展开液混合后点在试纸条的加样孔处，混合液通过毛细作用向前流动，当有扩增产物存在时，扩增产物一端修饰的生物素首先与金标垫上修饰有链霉素抗生物素化的胶体金结合，再与胶体金试纸条上的抗fitc抗体（检测线）、生物素（质控线）结合呈现直观的颜色反应，当没有扩增产物存在时，胶体金颗粒无法停留在检测线处，而被质控线上的生物素捕获，所以质控线的显色情况可以用来对试纸条进行质控，据此建立pcr-胶体金试纸条技术。使用方便的鲍曼不动杆菌pcr-胶体金免疫层析试纸条检测试剂盒，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并提供其简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。

2、本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

3、一种快速检测耐药鲍曼不动杆菌 oxa基因核酸胶体金试纸条的方法，其特征是，它包含：

4、1.特异性引物

5、基于鲍曼不动杆菌 oxa特异性基因片段使用ncbi primer-blast 5.0设计一对特异性引物并分别在5'端用生物素（biotin）、荧光素（fitc）进行修饰标记：

6、foxa（正向引物）：5'（fitc）tgggaaaaagacatgacactagg 3'

7、roxa（反向引物）：5'（biotin）gtcaaccagcccacttgtgg 3'

8、2.阳性对照品

9、将鲍曼不动杆菌特异性 oxa片段扩增、电泳鉴定后，进行凝胶回收、纯化、连接后转入大肠杆菌感受态细胞 dh5α，蓝白斑实验筛选阳性克隆；以质粒dna为模板进行扩增，pcr产物送至生工生物工程有限公司测序验证，分析测序结果，并将提取的质粒经pcr鉴定后稀释一定浓度作为试剂盒的阳性对照品。

10、3.鉴定体系

11、检测反应体系；阳性对照反应体系；阴性对照反应体系；三种体系均包括pcr反应体系和胶体金免疫层析试纸条体系。

12、（1）检测反应体系

13、pcr反应体系（20 μl）：2×taq pcr master mix 10 μl，待检dna模板（100 ng·μl-1） 2 μl，引物f、r（10 ng·μl-1）各1 μl，余用双蒸馏水补齐。

14、胶体金层析试纸条反应体系：金标垫胶体金滴加量25 μl，检测线抗荧光素抗体1mg·ml-1进行划线，质控线生物素化的牛血清白蛋白2 mg·ml-1进行划线，样品稀释液100μl，取上述待检pcr产物5 μl。

15、（2）阳性对照反应体系

16、pcr反应体系（20 μl）：2×taq pcr master mix 10 μl，大肠埃希菌克隆质粒dna模板（100 ng·μl-1）2 μl，引物f、r（10 ng·μl-1）各1 μl，6 μl双蒸馏水。

17、胶体金层析试纸条反应体系：金标垫胶体金滴加量25 μl，检测线抗荧光素抗体1mg·ml-1进行划线，质控线生物素化的牛血清白蛋白2 mg·ml-1进行划线，样品稀释液100μl，取上述待检pcr产物5 μl。

18、（3）阴性对照反应体系

19、pcr反应体系（20 μl）：2×taq pcr master mix 10 μl，双蒸馏水2 μl，引物f、r（10 ng·μl-1）各1 μl，6 μl双蒸馏水。

20、胶体金层析试纸条反应体系：金标垫胶体金滴加量25 μl，检测线抗荧光素抗体1mg·ml-1进行划线，质控线生物素化的牛血清白蛋白2 mg·ml-1进行划线，样品稀释液100μl，取上述待检pcr产物5 μl。

21、4.鉴定反应条件

22、鲍曼不动杆菌dna加入pcr鉴定反应体系，克隆质粒dna加入阳性对照反应体系，双蒸馏水加入阴性对照反应体系的反应管中，置于pcr扩增仪中按下列程序进行：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

23、取pcr 产物5 μl于ep管中加入100 μl样品稀释液混匀后，取50 μl稀释产物滴加与胶体金层析试纸条点样处，5 min后观察结果。

24、5.结果判定

25、取样品稀释液处理后的反应产物50 µl，滴加于胶体金层析试纸条点样处，静置5min后观察结果。试纸条中质控线颜色为红色的前提下，检测线出现红色，则证明试验阳性，pcr扩增出鲍曼不动杆菌 oxa基因特异性dna产物；若质控线颜色为红色，检测线不出现红色，则证明试验阴性，pcr没有扩增出鲍曼不动杆菌 oxa基因特异性dna产物。