马兜铃酸D的对照品的制备方法与流程

本发明涉及一种马兜铃酸d的制备方法，尤其涉及能够制备可以用于适用于工业化的马兜铃酸d的固体对照品的制备方法。

背景技术：

1、马兜铃酸类成分是一类硝基菲类羧酸，具有肾脏毒性和致癌性。已报道的大量马兜铃酸肾病病例中，有些马兜铃酸肾病患者后续发生尿路上皮癌和膀胱癌。泌尿系统致癌性的发现使马兜铃酸被列为ⅰ类致癌物。马兜铃酸类成分是一类植物次生代谢产物，广泛存在于马兜铃科植物中。马兜铃科植物共有500多种，在亚洲地区被作为传统药物用于治疗多种疾病。中国地区的马兜铃科植物主要有4属共70余种，其中大多数是药用植物，常作为中药材配伍使用，具有止咳平喘、祛风止痛和清热活血等功效。现在存于2020版药典中的马兜铃科植物仅有细辛一种，细辛临床应用广泛，主要用于治疗过敏性哮喘、鼻炎、咳嗽以及新型冠状病毒感染等症。除了入汤剂外，大量的中成药制剂中亦含有细辛。《中国药典》收载有50种含细辛品种。很多品种极为常用，如小青龙颗粒、儿童清肺口服液、小儿咳喘颗粒、痧气体丸、鼻渊舒口服液、小儿肺闭宁片、辛芩颗粒、九味羌活片、川芎茶调片、鼻炎片、胃炎宁冲剂、人参再造丸、正天丸、杜仲壮骨丸等，其中不乏儿童常用药。在含马兜铃、土木香、木通、防己、寻骨风等药材的中成药中均检测到了马兜铃酸成份。为了避免药物中的马兜铃酸类成分在实际应用中带来的毒性伤害，对马兜铃酸毒性进行早期诊断，对于其安全性监测极为重要。

2、常见的马兜铃酸类成分有马兜铃酸a、马兜铃酸b、马兜铃酸c、马兜铃酸d。目前国内外马兜铃酸a、马兜铃酸b、马兜铃酸c的相关研究很多，马兜铃酸d的研究报道很少，市场上也很少有现成的马兜铃酸d供应。然而，马兜铃酸d(aristolochic acid d)已经被列为《中华人民共和国药典》规定的毒性药材指标成分，其重要程度不容忽视。

3、

4、马兜铃酸d，分子式:c17h11no8

5、由于马兜铃酸d已被药典列为药典毒性指标成分，所以分离得到马兜铃酸d标准品能够极大的提高相关药材质量控制水平，显得十分必要，具有极高应用价值。

6、马兜铃酸d检测方面的专利文献较多，但是大量提取工艺方面的文献很少，大部分都是分离马兜铃酸d类似物。有文献报导通过醇提-碱溶酸沉-大孔树脂纯化-高压制备的方法，从关木通中分离获得马兜铃酸ⅰ和ii，纯度分别为96％和94.45％，没有得率数据。还有文献报导将马兜铃药材进行醇提，醇提物与硅胶拌样，烘干后依次用石油醚，氯仿，乙醇索氏提取，氯仿提取物经硅胶柱层析，重结晶获得马兜铃酸，从其它溶剂提取物中分离获得另外2中马兜铃酸类似物，未做结构鉴定，也没有纯度和得率数据。还有文献报导，通过醇提-浓缩析出-沉淀经酒精多次洗涤-硅胶柱层析-重结晶的方法，从朱砂莲中分离获得马兜铃酸，得率0.45％，没有纯度数据。

7、专利文献

8、[1]一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法cn113252810 a

9、非专利文献

10、[1]屈碧琼，刘洁，阳娇，杨晓芹，潘绮雪，刘明妍，刘璐璐，肖红斌.马兜铃酸ⅰ，ii的制备工艺研究[j].华西药学杂志，2022,37(3)：245-248.

11、[2]李舒养，姚琪.广西马兜中马兜铃酸的分离与鉴定[j].中国药学杂质，1981,(02)：15-18.

12、[3]邱运平，陈秀珍，全德健，文玲芳，巫燕妹.朱砂莲化学成分的研究ⅰ，马兜铃酸的分离[j].广西植物，1980,(01)：24-27.

13、现状是植物来源的马兜铃酸d的植物来源的提取分离困难，没有现成的工艺，其总含量低，难以从混合物中结晶出来，因此已经公开的马兜铃酸d的现有提取制备方法非常有限，目前尚无高效的相关的马兜铃酸d工业化提取制备方法。作为一种重要的特征性成分，迫切需要研发一种高通量、能提供高纯度的纯度马兜铃酸d，且适合大量制备的马兜铃酸d对照品制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高通量、能提供高纯度的纯度马兜铃酸d，且适合大量制备的马兜铃酸d对照品制备方法。本发明中，马兜铃酸d有时也称为分离目标物。本发明对马兜铃酸d的分离纯化做了很大的改进，引入了独特的ph调节手段，使整个提取方法适合于天仙藤药材化学成分的提取，再经过深入探索，找到了成本可控的提取分离手段，实现可以工业化的目标化合物提纯方法，在化合物的量和纯度上有了很大的提高，从而完成了本发明。

2、本发明通过简单高效的操作流程，能够分离得到纯度很高的马兜铃酸d。

3、本发明的制备分离方法依次包括以下步骤：

4、酸碱处理工序，将天仙藤药材总提取物粉末或浸膏，以3～7倍重量的ph值8～9的碱化的水溶液混悬，静置0.5～1.5小时后，以再以0.8～4倍体积的有机溶剂萃取，回收水相，加入酸性水溶液，调节ph至3～4，用0.8～4倍体积的体积有机溶剂萃取，回收有机相，浓缩得到天仙藤总提取物ii，

5、聚酰胺纯化工序，将天仙藤总提取物ii上样于100～200目聚酰胺柱层析，以乙酸乙酯：甲醇＝20:1～10:1洗脱液逐渐增加极性进行洗脱，根据tlc或者hplc检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥，天仙藤粗提物i，其中，甲醇中含有8体积％～12体积％的甲酸以及8体积％～12体积％的水；

6、反相色谱纯化工序：天仙藤粗提物i上样至反相色谱柱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.7:1，根据tlc或者hplc检测收集洗脱液，将洗脱液在50℃以下的温度减压浓缩，干燥得到马兜铃酸d的粗品ii溶液，乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂中可选地含有0.1％～0.3％乙酸；

7、溶剂处理工序，将反相色谱纯化工序中所得到马兜铃酸d的粗品ii溶液在50℃以下的温度浓缩，得到析出物，淋洗，干燥之后获得马兜铃酸d的对照品。

8、溶剂处理工序所得的马兜铃酸d的对照品，可以利用重结晶方法进行纯化，优选重复进行2次以上重结晶，例如在本发明优选的实施方式中，将反相色谱纯化工序中所得到马兜铃酸d粗品ii用醇系溶剂溶解，于-30℃～0℃结晶，过滤获得结晶，再进行2次以上重结晶。

9、在本发明优选的实施方式中，所述天仙藤药材总提取物溶液的制备方法如下，将天仙藤药材粉碎，加入5～20倍重量的醇系水溶液，室温浸泡或者热回流提取10～60小时，过滤，浓缩，得天仙藤药材总提取物溶液。

10、在本发明优选的实施方式中，反相色谱纯化工序可先进行中低压反相色谱纯化工序，再进行高压反相色谱纯化工序，其中例如，中低压反相色谱纯化工序：将天仙藤粗提物i上样至反相色谱柱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以0.5～1mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.6:1，根据tlc或者hplc检测收集洗脱液，将洗脱液在50℃以下的温度减压浓缩，去除其中的乙腈或甲醇，得到含有马兜铃酸d的粗品ii-1；高压反相色谱纯化工序：将马兜铃酸d的粗品ii-1上样至反相色谱柱，用可选地含有0.1％～0.3％乙酸的乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以1～15mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.67:1，，根据tlc或者hplc检测收集洗脱液，得到马兜铃酸d的粗品ii溶液。

11、需要说明的是，中低压、高压并非基于本领域严格的定义，本发明中的中低压色谱只要没有特殊限定，都按照上述表述，代表0.5～1mpa的压力的色谱，高于1mpa的色谱，在本发明中称为高压色谱。

12、在本发明优选的实施方式中，醇系溶剂例如优选甲醇、乙醇、正丁醇等，醇系的水溶液为60％～90％的甲醇水溶液或者60％～90％的乙醇水溶液。

13、在本发明优选的实施方式中，反相色谱纯化工序中，以压力为0.1～0.3mpa进行洗脱，采用乙腈和水的混合液进行洗脱，选用40～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶填料；在高压反相色谱纯化工序中，反相色谱柱的填料为粒径为5-10μm的十八烷基硅烷键合硅胶，使用乙腈：水洗脱液，溶液的比例以体积比计为0.5～0.7:1的洗脱剂进行洗脱。

14、在本发明优选的实施方式中，酸碱处理工序，酸化水溶液为8wt％～10wt％的盐酸，碱性溶液为碳酸氢钠溶液。

15、在本发明优选的实施方式中，酸碱处理工序中，用于萃取的有机溶剂为选自卤代烃溶剂、酯类溶剂中的一种，卤代烃溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、1，1，2-三氯乙烷、1，1，1，2-四氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、五氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯及四氯乙烯中的一种或多种的组合，酯类溶剂为选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸苯酯、苯甲酸甲酯、乙酸丁酯、丙烯酸辛酯中的一种或多种的组合。

16、本发明还提供一种纯度为99.5％以上的马兜铃酸d的固体对照品，其通过本发明的制备方法制备得到，本发明的方法制备的对照品hplc纯度高，成本优势明显。

17、本发明具有以下特点：

18、1.本发明操作简单高效，能够进行工艺放大，分离得到大量马兜铃酸d单体；

19、2.本发明经过生产实践从500kg天仙藤药材中分离获得60g马兜铃酸d，纯度99.8％，得率0.012％，纯度相对文献有了很大的提升，可作为对照品供检测使用，在文献专利报导中尚属首次。本发明分离到获得60g马兜铃酸d，根据需求，还可以放大至百克级，因此在针对制备方法、通量上都有较大改进。

20、3.酸碱处理组合结合聚酰胺，实现了大量目标物的快速富集，增加了最终的回收率。