经分离的Cas13蛋白、基于它的基因编辑系统及其用途

本技术为生物，具体涉及经分离的cas13蛋白，基于它的基因编辑系统以及使用它们进行rna水平基因编辑的方法。

背景技术：

1、基因编辑(gene editing)技术使得dna序列定位点进行改造成为可能，比如第一代基因编辑工具锌指核酸酶(zinc fingernucleases,zfns)，第二代基因编辑工具类似转录激活的小型核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,talens)，第三代基因编辑工具中的ii型及v型的成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr,clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/cas(crispr-associated protein)都可以用于靶向改造基因组，但这些基因编辑系统只能靶向基因组及外来的dna，而不能对体内rna进行靶向编辑。

2、vi型的crispr/cas13系统，是来自古生菌和细菌的天然免疫系统。其不同于以往基因编辑工具，利用核酸碱基互补配对原理进行目标rna序列的识别，引导cas效应蛋白进行靶向切割，适用性强、设计简单、效率高。

3、其中，vi-d型crispr/cas13基因编辑系统是现下应用较为广泛的vi型crispr/cas系统。这一系统在原核生物中可通过识别并切割靶向的多核苷酸上双侧的原间隔序列侧翼位点(protospacer flanking site,pfs)序列，从而对单链rna进行靶向编辑，而在真核生物中，vi-d型crispr/cas系统对rna的靶向编辑作用无pfs序列。同时相比于其他vi型系统，vi-d型系统具有更小的蛋白体积，在基于腺相关病毒(adeno-associatedvirus,aav)的基因治疗具有更好的前景。在庞大以及各色各样的宏基因组中，隐藏了尚未培养甚至尚未发现的微生物，可能存在大量的未被发现的vi型crispr/cas13系统，在这些微生物中寻找和克隆获得更具优良特性的cas蛋白是人们所期望的。

技术实现思路

1、本技术的目的就是在宏基因组中寻找新型cas13基因编辑系统并开发其用途。具体地提供了：

2、1.经分离的cas13核酸酶蛋白，所述cas13蛋白的氨基酸序列包括：

3、a)如seq id no.1～28中任一项所示的氨基酸序列；或，

4、b)与seq id no.1～28中的任一项具有至少80％序列同一性、且具有rna切割活性的氨基酸序列。

5、2.如项2所述的cas13核酸酶蛋白，其中所述cas13蛋白是cas13bt1、cas13bt2、cas13g、cas13h、cas13i、cas13j或cas13k蛋白。

6、3.一种工程化的cas13核酸酶效应蛋白，包含:

7、a)如seq id no.1～28中任一项所示的氨基酸序列；或，

8、b)与seq id no.1～28中的任一项具有80％以上序列同一性、且具有rna切割活性的氨基酸序列。

9、4.项3的效应蛋白，其中所述cas13核酸酶效应蛋白通过氨基酸突变失去催化活性，例如所述cas13核酸酶蛋白在其c端、n端的hepn结构域(rxxxxh基序)进行突变形成dcas13蛋白。

10、5.项3或4所述的效应蛋白，其还包含与所述cas13核酸酶蛋白融合的功能结构域。

11、6.项5所述的效应蛋白，所述功能结构域选自如下的一项或多项：翻译起始结构域、翻译阻遏结构域、反式激活结构域、表观遗传修饰结构域、核碱基编辑结构域、逆转录酶结构域、报告分子结构域和核酸酶结构域。

12、7.项6所述的效应蛋白，其中所述核碱基编辑结构域为腺苷脱氨酶、胞苷脱氨酶或所述它们的催化结构域融合。

13、8.一种多核苷酸，其编码项1或2的cas13核酸酶蛋白或项3-7任一项的效应蛋白。

14、9.包含如项8所述的多核苷酸的载体，优选所述载体为质粒或慢病毒。

15、10.一种工程化的crispr-cas13基因编辑系统，包含：

16、(a)项3-7中任一项所述的工程化cas13核酸酶效应蛋白或编码所述效应蛋白的核酸；以及

17、(b)crrna，其包含与靶序列互补的间隔区序列，当分别使用如seq id no.1～28所示的工程化cas13核酸酶效应蛋白时所述crrna还分别包含与seq id no.29～56所示的序列具有至少80％同一性的直接重复(directrepeat,dr)序列；

18、其中所述工程化的cas13核酸酶效应蛋白和所述crrna能够形成crispr复合物，所述crispr复合物特异性结合包含所述靶序列的靶核酸并诱导所述靶核酸的修饰。

19、11.包含如项10所述的工程化的crispr-cas13基因编辑系统的试剂盒。

20、12.如项3-7任一项所述的工程化的crispr-cas13核酸酶效应蛋白、项10的工程化的crispr-cas13基因编辑系统在制备治疗与个体的细胞中与核酸突变相关的疾病或病症的药物中的用途。

21、13.一种修饰细胞中包含的靶核酸的方法，包括使所述细胞与项3-7任一项所述的工程化的crispr-cas13核酸酶蛋白效应蛋白、项10的工程化的crispr-cas13基因编辑系统接触从而实现对细胞中所述靶核酸的修饰。

22、14.如项3-7任一项所述的工程化的crispr-cas13核酸酶效应蛋白或项10的工程化的crispr-cas13基因编辑系统的用于制备用来治疗个体中与核酸突变相关的疾病或病症的药物的用途。

23、本技术还提供了：

24、1.经分离的cas13核酸酶蛋白，所述cas13核酸酶蛋白的氨基酸序列为：

25、a)如seq id no.1～28中任一序列所示的氨基酸序列；或，

26、b)与seq id no.1～28中的任一序列具有至少80％的序列同一性、且具有rna切割活性的氨基酸序列。

27、2.如项1所述的cas13核酸酶蛋白，其中所述cas13核酸酶蛋白是cas13bt1、cas13bt2、cas13g、cas13h、cas13i、cas13j或cas13k蛋白，优选为cas13g3。

28、3.一种工程化的cas13核酸酶效应蛋白，包含cas13核酸酶蛋白，该cas13核酸酶蛋白包含:

29、a)如seq id no.1～28中任一序列所示的氨基酸序列；或，

30、b)与seq id no.1～28中的任一序列具有80％以上序列同一性、且具有rna切割活性的氨基酸序列。

31、4.如项3的所述效应蛋白，其中所述cas13核酸酶蛋白通过氨基酸突变失去催化活性，例如所述cas13核酸酶蛋白在其c端和/或n端的hepn结构域(rxxxxh基序)通过氨基酸突变形成dcas13蛋白。

32、5.项3或4所述的效应蛋白，其还包含与所述cas13核酸酶蛋白融合的功能结构域。

33、6.如项5所述的效应蛋白，所述功能结构域选自如下的一项或多项：翻译起始结构域、翻译阻遏结构域、反式激活结构域、表观遗传修饰结构域、核碱基编辑结构域、逆转录酶结构域、报告分子结构域和核酸酶结构域。

34、7.如项6所述的效应蛋白，其中所述核碱基编辑结构域为腺苷脱氨酶、胞苷脱氨酶或它们的催化结构域。

35、8.一种多核苷酸，其编码项1或2的cas13核酸酶蛋白或项3-7任一项的效应蛋白。

36、9.包含如项8所述的多核苷酸的载体，所述载体为质粒或病毒，所述病毒优选为慢病毒。

37、10.一种工程化的crispr-cas13基因编辑系统，包含：

38、(a)如项1或2所述的核酸酶、如项3-7中任一项所述的工程化cas13核酸酶效应蛋白或编码所述效应蛋白的核酸；以及

39、(b)crrna，其包含与靶核酸中的靶序列互补的间隔区序列；

40、其中所述工程化的cas13核酸酶效应蛋白和所述crrna能够形成crispr复合物，所述crispr复合物特异性结合包含所述靶序列的靶核酸并诱导所述靶核酸的修饰。

41、11.如项10所述的crispr-cas13基因编辑系统，其中所述crrna还包含直接重复(dr)序列，优选所述直接重复(dr)序列包含seq id no.29～56中任一序列所示的序列，或包含与seq id no.29～56中任一序列所示的序列具有至少80％同一性的序列。

42、12.包含如项10或11所述的工程化的crispr-cas13基因编辑系统的试剂盒。

43、13.如项1或2所述的cas13核酸酶蛋白、如项3-7中任一项所述的工程化的crispr-cas13核酸酶效应蛋白、如项10或11所述的工程化的crispr-cas13基因编辑系统在制备治疗与个体的细胞中与核酸突变相关的疾病或病症的药物中的用途。

44、14.一种修饰细胞中包含靶核酸的方法，包括使所述细胞与如项1或2所述的cas13核酸酶蛋白、如项3-7任一项所述的工程化的cas13核酸酶效应蛋白、如项10或11所述的工程化的crispr-cas13基因编辑系统接触，从而实现对所述细胞中所述靶核酸的修饰。

45、15.包含如项1或2所述的cas13核酸酶蛋白、如项3-7任一项所述的工程化的cas13核酸酶效应蛋白或如项10或11所述的工程化的crispr-cas13基因编辑系统的组合物，其用于核酸的修饰。

46、本技术的技术方案实现的有益技术效果

47、本技术通过对宏基因组数据进行分析，最后鉴定出5个全新亚型共75个cas13蛋白。全新cas13亚型命名为cas13g-k；其中cas13g蛋白质大小约为800个氨基酸，cas13h-k蛋白大小约为1100个氨基酸。这些新型蛋白都体现了良好的rna水平的靶向切割活性。我们报道新发现的cas13g3蛋白可以设计成可编程的rna编辑。cas13g3体积为767aa，被认为是目前效率最高的小cas13蛋白，可被用作有前途的哺乳动物rna编辑工具。