一种从血浆中提取分离IgM与凝血因子Ⅶ的方法与流程

本发明涉及血液制品生产，具体涉及一种从血浆中提取分离igm与凝血因子ⅶ的方法。

背景技术：

1、igm在抗体介导的体液免疫反应中表现出极强的抗原中和及免疫调节作用等，是机体抗感染和免疫刺激后首先产生的抗体，igm也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是集体感染的“先头部队”。igm占血清免疫球蛋白总量的5％～10％,单体igm以膜结合型表达于细胞表面，构成b细胞抗原受体，分泌型igm为五聚体，是分子量最大的免疫球蛋白，主要存在于血液中，且具有很强的抗原结合能力，igm是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，在胚胎发育晚期的胎儿即能产生igm，故脐带血igm升高提示胎儿有宫内感染。国际上现有的免疫球蛋白生产技术主要采用低温乙醇法及低温乙醇法与层析技术相结合等手段，且都是为了分离igg，将igm、iga等作为杂蛋白去除。

2、凝血因子是参与血液凝固过程的蛋白质组分，血浆中参与血液凝固的凝血因子有十几种，其中，人凝血因子ⅶ是外源性凝血途径中引发凝血联级反应的起始因子，是由肝细胞合成的维生素k依赖性具有丝氨酸蛋白酶水解作用的酶原。人凝血因子ⅶ在临床上主要用于治疗凝血因子ⅶ缺乏症即血友病，目前，人凝血因子ⅶ分离工艺主要是以血浆为原料首先生产人凝血酶原复合物(pcc)，再提纯得到。此种工艺复杂，且回收率低。

3、考虑到igm和凝血因子的各项性能上的区别，为保证igm和凝血因子制品的质量，现有技术中针对上述两种成分的分离富集几乎都是分开进行，尚未有对两种物质同时纯化的可产业化生产的工艺技术的相关报道。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种从血浆中提取分离igm与凝血因子ⅶ的方法，以解决现有的制备工艺无法直接从血浆中同时纯化富集igm和人凝血因子ⅶ的技术问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种从血浆中提取分离igm与凝血因子ⅶ的方法，包括以下依次进行的步骤：

4、s1：去冷胶血浆经ph值和电导率调整之后，上样于第一次阴离子交换层析柱，再依次通过第一洗脱液和第二洗脱液的洗脱处理，获得第一离子层析产物；

5、s2：第一离子层析产物经超滤、透析以及ph值和电导率后，上样于凝胶过滤层析柱，分别收集第一紫外峰对应流穿液以及第三紫外峰对应流穿液，分别获得含igm的第一凝胶过滤层析产物以及含凝血因子ⅶ的第二凝胶过滤层析产物。

6、采用上述技术方案的原理以及有益效果在于：

7、层析工艺分离法可用于初分离、中度分离及精细分离，层析分离精度高、设备简单、操作方便，根据不同原理的层析法广泛应用于蛋白质的分离纯化，层析是一种有效的分离手段，是重要的蛋白质纯化工具。随着高分子化学的不断发展，凝胶层析工艺在各个方面的应用越来越广泛。层析介质可重复使用、分离效果好、重复性高，最突出的是样品的回收率高。本技术方案使用全层析的方法分离纯化凝血因子ⅶ和igm，实现了同时从血浆中分离两种物质，并且获得的凝血因子ⅶ制品和igm制品品质理想，符合应用要求。本技术方案大大提高来之不易的血浆原材料的利用率，且简化了操作步骤，具有较大的实际应用价值。

8、igm和凝血因子的各项性能上的区别，为保证igm和凝血因子制品的质量，现有技术中针对上述两种成分的分离富集几乎都是分开进行。发明人在不断探索过程中，发现采用层析法从血浆中吸附ⅱ因子、ⅶ因子、ⅸ因子、ⅹ因子时，可同时吸附免疫球蛋白igm，且不影响流穿液中同为免疫球蛋白的igg、白蛋白等其他蛋白成分。ⅱ因子、ⅶ因子、ⅸ因子、ⅹ因子可用于制作凝血酶原复合物(即pcc)。发明人在大量筛选研究中意外的发现，采用本技术方案的层析方式，还可通过第一次阴离子交换层析，将ⅱ因子、ⅸ因子、ⅹ因子和ⅶ因子、免疫球蛋白igm分开，且ⅱ因子、ⅸ因子、ⅹ因子保留在层析柱上。ⅱ因子、ⅸ因子、ⅹ因子可用于制作高浓度ⅸ因子产品，ⅶ因子、免疫球蛋白igm经过再分离分别制作高纯度的ⅶ因子和igm产品。

9、发明人在研究初期，探索了多种将ⅶ因子与ⅱ因子、ⅸ因子、ⅹ因子等分离的方法，在采用本技术方案的工艺顺序以及条件的情况下，不仅实现了ⅶ因子与ⅱ因子、ⅸ因子、ⅹ因子的有效分离，还能够同时将ⅶ因子和igm共分离，获得了预料不到的技术效果。接下来，二者可以通过分子量的区别实现进一步分离，且操作过程简单。

10、进一步，还包括s3-1：第一凝胶过滤层析产物经ph和电导率调整之后，上样于第二次阴离子交换层析柱，收集流穿液获得第二离子层析产物。并且在上样前，使用第三平衡液平衡第二次阴离子交换层析柱；第三平衡液为0.015～0.075mol/l醋酸钠-醋酸缓冲液，ph值为4.5～5.5。

11、进一步，在s3-1中，第二次阴离子交换层析柱的填料为阴离子交换层析填料；将第一凝胶过滤层析产物的ph值调整为4.5～5.5，电导率调整为1.5～7.5ms/cm，然后再上样。

12、进一步，在s3-1中，第二离子层析产物经超滤、透析，以及浓度、ph和电导率调整，并加入山梨醇和甘氨酸，获得igm制品粗品；对igm制品粗品进行巴氏灭活，再经过超滤、透析，以及浓度和ph调整，并加入麦芽糖以及过滤分装，获得igm制品成品。

13、进一步，还包括s3-2：第二凝胶过滤层析产物经过超滤、透析，以及浓度和ph调整，并加入甘氨酸、精氨酸和盐酸赖氨酸，获得凝血因子ⅶ粗品；凝血因子ⅶ粗品经分装以及冻干、干热灭活处理，获得凝血因子ⅶ成品。

14、进一步，在s1中，第一次阴离子交换层析柱的填料为阴离子交换填料；在上样前，使用第一平衡液平衡第一次阴离子交换层析柱；第一平衡液为10～20mm柠檬酸钠，ph值为6.3～7.6，电导率为9～13ms/cm。

15、进一步，在s1中，第一洗脱液为10～20mm柠檬酸钠，ph值为6.3～7.6、电导率为15～30ms/cm；第二洗脱液为0.5～1m谷氨酸钠溶液，ph值为6.8～7.7、电导率为19～30ms/cm。

16、进一步，在s1中，将去冷胶血浆经ph值调整为6.3～7.6，电导率调整为9～13ms/cm，然后再上样。

17、进一步，在s2中，凝胶过滤层析柱的填料为葡聚糖凝胶；在上样前，使用第二平衡液平衡凝胶过滤层析柱；第二平衡液为含有10～20mm柠檬酸钠和0.13～0.17m氯化钠的混合溶液，ph值为7.2～8.0，电导率为14～20ms/cm。

18、进一步，在s2中，第一离子层析产物的ph值调整为7.2～8.2，电导率调整为14～20ms/cm。

19、综上所述，本技术方案的有益效果在于：

20、(1)全层析工艺无低温乙醇沉淀步骤，不需要低温，节能降耗；不需要乙醇，减少安全风险，提高厂房安全；

21、(2)全层析工艺具有操作简单、所需设备单一，层析介质可重复使用及分离效果好，重复性高，最突出的是ⅶ因子和igm的回收率高。

22、(3)本技术在ⅶ因子的分离纯化中采用阴离子交换、凝胶过滤等手段相结合，使血浆中不同蛋白质的分离变得简单，同时还能大大提高来之不易的血浆原材料的利用率，特别是同时从血浆中分离了igm和ⅶ因子。

23、(4)ⅶ因子比活可达25iu/mg蛋白，远高于欧洲药典规定的2iu/mg蛋白。

24、(5)igm蛋白质的纯度可达90％以上，igm总收率理想。