一种用于东方蜜蜂微孢子虫检测的基因片段、引物对、试剂盒以及检测方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种用于东方蜜蜂微孢子虫检测的基因片段、引物对、试剂盒以及检测方法。

背景技术：

1、蜜蜂是一种资源昆虫，不仅在保护生态多样性、维持生态平衡方面极为重要，其各类蜂产品还具有巨大的经济效益。在众多病害中，微孢子虫是一种有着特殊的侵染装置（极管）的寄生虫，入侵中肠后可利用蜜蜂体内营养物质大量增殖，受感染的成年工蜂会出现消化系统紊乱、寿命缩短、采集能力下降、易受病菌感染等现象，最终导致蜂群数量下降，甚至蜂群崩溃。

2、微孢子虫，有1200多种，是最小个体的寄生原虫，广泛寄生于节肢动物、鸟类、哺乳动物和人类。目前，发现的蜜蜂微孢子虫有西方蜜蜂微孢子虫、熊蜂蜜蜂微孢子虫、东方蜜蜂微孢子虫 （nosema ceranae，n.ceranae）。我国现主要养殖蜂种除了本土蜂种—中华蜜蜂外，还有20世纪早期引进的意大利蜜蜂，研究发现东方蜜蜂微孢子虫可以感染上述两种蜜蜂，且感染力极强。目前，东方蜜蜂微孢子虫困扰着蜜蜂养殖业的发展，该疾病传播途径多样、传播速度快，一旦在蜂群中爆发会造成蜂农巨大的经济损失，针对东方蜜蜂微孢子虫感染也无好的治疗手段，所以研究针对它的高效检测技术十分必要。

3、关于东方蜜蜂微孢子虫的检测方法有镜检、免疫学以及分子生物学三种方法。首先，镜检，该方法是使用光学显微镜观察视野中是否出现孢子，该法简单易学、实用性强，相较于肉眼观察高效了很多。但该法对工作人员的经验要求较高，且当片子中孢子数量很少或者处于感染初期时极易漏检，检测结果的灵敏度和准确性差异较大，另外孢子发育可分为孢原质期、裂殖期、产孢期以及成熟孢子期四个阶段，前三个发育期很难在显微镜下观察到，必然会存在漏检的情况，对于有效、及时地控制东方蜜蜂微孢子病害的作用有限。同时，镜检需要大量的人员，经济成本也随之较高。其次，针对免疫学检测方法，2009年刘锋利用东方蜜蜂微孢子虫总蛋白免疫兔子得到多克隆兔抗，通过对elisa的反应条件进行优化，从而用于东方蜜蜂微孢子虫检测。该方法与普通光学显微镜检相比，灵敏度有了较大的提高，孢子的检测灵敏度达103个/ml，且该法检测周期较短，肉眼即可初步判定，这都有效地缩短了疾病确诊的时间，有利于进一步采取防治措施。但此法在检测前，抗血清的制备及东方蜜蜂微孢子虫的处理稍显繁琐，而且多克隆抗体特异性较低，结果准确度有待提高。

4、分子生物学主要是利用pcr扩增技术，该方法灵敏度高，特异性好，能进行批量操作，但目前对微孢子虫检测的研究主要集中于家蚕微孢子虫检测领域，而对东方蜜蜂微孢子虫研究甚少，尤其是一种针对东方蜜蜂微孢子虫检测的特异性、准确性好的检测方法仍未见报道。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于东方蜜蜂微孢子虫检测的基因片段、引物对、试剂盒以及检测方法，以解决现有技术中存在的缺陷。

2、为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供的一种用于东方蜜蜂微孢子虫检测的基因片段，所述基因片段具有如seq id no：1所示的核苷酸序列。

4、第二方面，本发明还提供一种用于东方蜜蜂微孢子虫检测的特异性引物对，所述特异性引物对用于特异性检测核苷酸序列如seq id no：1所述的基因片段。

5、优选地，所述特异性引物对包括核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物。

6、进一步优选地，所述荧光基团为6-fam。

7、第三方面，本发明还提供一种用于东方蜜蜂微孢子虫检测的修饰引物对，所述修饰引物对用于特异性检测核苷酸序列如seq id no.1所示的基因片段，且所述修饰引物对包括5’端修饰有第一显色基团的上游引物和5'端修饰有第二显色基团的下游引物。

8、优选地，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。

9、优选地，所述第一显色基团和第二显色基团为硫氰酸荧光素fitc、6-fam或生物素biotin中的任意一种，且所述第一显色基团不同于所述第二显色基团。

10、第四方面，本发明还提供一种用于东方蜜蜂微孢子虫检测的试剂盒，所述试剂盒用于特异性检测核苷酸序列如seq id no：1所述的基因片段，或所述试剂盒包括具有上述第二方面提供的特异性引物对，或所述试剂盒包括上述第三方面提供的修饰引物对。

11、第五方面，本发明提供一种上述第一方面提供的用于东方蜜蜂微孢子虫检测的基因片段及其编码蛋白、第二方面提供的用于东方蜜蜂微孢子虫检测的特异性引物对或上述第三方面提供的用于东方蜜蜂微孢子虫检测的修饰引物对、或上述第四方面提供的试剂盒在防治东方蜜蜂微孢子虫方面的应用，优选地，所述应用为在特异性检测东方蜜蜂微孢子虫方面的应用。

12、第六方面，本发明还提供一种东方蜜蜂微孢子虫检测方法，该方法采用上述第二方面提供的特异性引物对、或上述第三方面提供的修饰引物对、或上述第四方面提供的试剂盒对东方蜜蜂微孢子虫进行检测。

13、第七方面，本发明还提供一种东方蜜蜂微孢子虫检测方法，该检测方法具体包括步骤：

14、获取待检测蜜蜂的总基因组；

15、构建pcr反应体系并进行pcr反应，构建pcr反应体系并进行pcr反应，所述pcr反应用于特异性扩增核苷酸序列如seq id no：1所示的基因片段；

16、对pcr反应结果进行判读，以此确定所述待检测蜜蜂是否感染东方蜜蜂微孢子虫。

17、优选地，获取待检测东方蜜蜂的总基因组通过以下方式获得：

18、选择待检测蜜蜂消化道的中肠部分，用高通量组织破碎仪破碎并以破碎后的样品作为待提取样本，采用基因组提取试剂盒从待提取样本中获得待检测蜜蜂的总基因组。

19、优选地，所述pcr反应体系包括premix star maxdna polymerase 12.5ul、上游引物 0.2ul、下游引物 0.2ul、dna模板 0.5ul、灭菌后ddh2o 11.6ul以及dmso 0.5ul。

20、优选地，所述pcr反应程序为：98℃预变性5分钟；98℃ 10s，退火 15s，72℃ 30s，共22个循环；72℃延伸10分钟；进一步优选地，所述退火温度为58.6℃、60.1℃、61.9℃、63.4℃，最优选为61.9℃。

21、优选地，所述判读通过凝胶电泳或侧向层析试纸实现；

22、进一步优选地，所述判读通过侧向层析试纸实现，具体地，所述pcr反应体系中的上游引物修饰有biotin基团，所述下游引物修饰有6-fam基团，所述侧向层析试纸包被有胶体金标记的抗fam抗体和链霉亲和素，从而实现pcr结果的可视化判断。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

24、首先，本发明基于一种新的用于东方蜜蜂微孢子虫检测的基因片段来设计可用于特异性检测该东方蜜蜂微孢子虫的特异性引物对，其中，特异性引物对ncptp3-13对东方蜜蜂微孢子虫的检测具有较好的特异性和准确性。其次，本发明基于上述特异性引物对ncptp3-13还进一步对其进行修饰，并提供一种修饰引物对ncptp3-13，通过该修饰引物对ncptp3-13结合侧向层析试纸条，可进一步提高该特异性引物对ncptp3-13对东方蜜蜂微孢子虫检测的灵敏度和可视度，从而解决现有技术存在的缺陷，可及时、及早并且准确地检测出蜜蜂的东方蜜蜂微孢子虫感染情况，实现对东方蜜蜂微孢子虫的有效防控。