基于流式分选的鸡原代T细胞的体外分离及培养方法

本发明属于细胞分离培养领域，是一种t细胞体外分离及培养方法，是一种保证细胞纯度的单种类细胞的体外培养方法。

背景技术：

1、免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。t淋巴细胞是具有细胞免疫功能的细胞，对b细胞起促进作用，以及对免疫细胞起抑制、调整作用的细胞，所组成细胞群总称，又称胸腺依赖性淋巴细胞，是淋巴细胞主要组分。它具有多种生物学功能，比如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制b细胞产生抗体。对于特异性抗原和促有丝分裂原应答反应，以及产生细胞因子等，使免疫效应扩大和增强。

2、流式分选技术是一种细胞分离技术，其原理是当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

3、免疫磁珠细胞分选法是把细胞用超级顺磁性的(macs微型磁珠)特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。小磁珠的优点：(1)对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养；(2)可直接上流式检测，不影响散射光。小磁珠的缺点：(1)需要很强的磁场来分离细胞；(2)分离速度很慢，得率不高；(3)一次性的分离柱，不能在普通试管进行；(4)成本昂贵。大磁珠的优点：(1)技术简单，分离可在试管中完成；(2)易于增减细胞用量；(3)速度快，得率高；(4)成本低。缺点：(1)对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养；(2)纯度低；(3)容易阻塞fcm的喷嘴。

4、鸡的t淋巴细胞对于抗沙门菌感染起着至关重要的作用，但是各种t细胞与抗原递呈细胞间的相互作用并不清楚，因此，我们迫切的需要一种能够放大单种细胞间相互作用的培养方法。流式分选能够分选出更高纯度的细胞，因此，建立一种基于流式分选下的细胞培养条件的确定显得尤为重要。

技术实现思路

1、鉴于以上所述的需求，本发明的目的在于建立一种基于流式分选下的t细胞体外培养技术，以满足高纯度细胞放大细胞间相互作用的需求。

2、本发明的一个目的在于通过流式分选得到高纯度的t细胞。

3、本发明的另一个目的在于确定流式分选后的t淋巴细胞的培养方法。

4、本发明提供的技术方案如下：

5、基于流式分选的鸡原代t细胞的体外分离及培养方法，包括以下步骤：从鸡外周血中分离出免疫细胞，并进行分选前样品处理；流式分选仪分选经过样品处理后的细胞；对经过流式分选仪分选后的cd3抗体阳性的t淋巴细胞进行纯度检测，并将经过流式分选仪分选后的cd3抗体阳性的t淋巴细胞与感染沙门菌后的巨噬细胞共培养，检测共培养后t细胞的il-6和il-1β产生情况，得到鸡原代t细胞。

6、进一步的，经过流式分选仪分选后的cd3抗体阳性的t淋巴细胞的培养温度为37℃。

7、进一步的，经过流式分选仪分选后的cd3抗体阳性的培养基中含有10％胎牛血清。

8、进一步的，对经过培养的cd3抗体阳性的t淋巴细胞提取rna，采用qrt-pcr方法对il-6和il-1β产生情况进行检测。

9、进一步的，qrt-pcr方法采用的引物序列如下：

10、

11、

12、进一步的，qrt-pcr反应体系如下：

13、

14、进一步的，对鸡外周血中分离出免疫细胞采用表面抗体mouse anti-chickencd3-pe标记。

15、进一步的，所述分选前样品处理包括以下步骤：

16、采用翅静脉采血法用肝素锂抗凝管收集鸡抗凝血；在离心管中贴壁加入分离液和新鲜抗凝血，离心后液体分层，用吸管缓慢吸出白膜层，将收集到的白膜层细胞用清洗液稀释洗涤并离心；用pbs重悬细胞，并加入mouse anti-chicken cd3-pe，吹打混匀，避光孵育，离心pbs重悬细胞。

17、进一步的，所述流式分选仪分选细胞包括以下步骤：

18、将经过处理后的免疫细胞悬液压入流式细胞以流动室进行检测，液流系统将样本悬液定位在光源的中心处，激发光学系统，当一个细胞流经过流式细胞仪器的激光束时，对散射和荧光检测器产生光脉冲，光脉冲随后被转化为电压脉冲；流式检测仪内的检测分析系统将脉冲信号转化为数字信号，计算出每个脉冲峰的高度、宽度和面积；进行facs法细胞分选，分选cd3抗体阳性的t淋巴细胞。

19、进一步的，所述纯度检测包括以下步骤：

20、通过流式细胞术测定cd3+t细胞的纯度；用直方图或散点图显示流式细胞仪得到的数据；使用fsc-ssc物理图圈定目标细胞群，排除多细胞团块的影响；通过h和a参数，取出粘连细胞，fsc-w/ssc-a通道圈定fsc-w坐标50-100所有细胞；通过圈出细胞所占总细胞的比例分析分选所得细胞的纯度。

21、本发明技术方案的进一步改进在于，所述分选细胞包括以下步骤：

22、1.采用翅静脉采血法用肝素锂抗凝管收集5ml鸡抗凝血并使用密度梯度离心法分离pbmcs。

23、将上述所得细胞用200μl含有1％ bsa的pbs重悬细胞，并加入2.5μl的mouseanti-chicken cd3-pe，吹打混匀。4℃，避光孵育30min。

24、4℃，1000r/min，离心5min。弃上清，用2ml含pbs重悬细胞，上述条件离心，弃上清，洗涤三遍。用含2.5％bsa的pbs重悬细胞，将细胞转移至流式管中。并利用流式分选仪进行分选。

25、2.所述确定流式分选后的t淋巴细胞的培养方法

26、①将细胞于不同温度下培养并比较死亡率；

27、②将细胞于含不同种类血清培养基中培养并比较死亡率；

28、③将细胞于含不同浓度胎牛血清培养基中培养并比较死亡率；

29、④将细胞于含与不含hepes浓度培养基中培养并比较死亡率；

30、①分选出的cd3+t细胞于含有10％fbs和2％青、链霉素的rpmi1640中培养，分别置于37℃和42℃细胞培养箱中培养。每天检测细胞死亡率。

31、②分选出的cd3+t细胞分别于含有10％fbs、10％鸡血清和5％fbs+5％鸡血清和2％青、链霉素的rpmi1640中，置于37℃，5％co2培养。每天检测细胞死亡率。

32、③分选出的cd3+t细胞分别于含有10％fbs、20％fbs、30％fbs、40％fbs和50％fbs，2％青、链霉素的rpmi1640中，置于37℃，5％co2培养。每天检测细胞死亡率。

33、④分选出的cd3+t细胞分别于含和不含有20mm的hepes的rpmi1640(含有10％fbs和2％青、链霉素)中，置于37℃，5％co2培养。每天检测细胞死亡率。

34、3.一种检测细胞死亡的方法

35、取培养基1/10体积的10-50μm的pi溶液，在37℃培养细胞10-20min。用pbs洗涤细胞两次。然后用流式细胞仪检测。

36、分选后的cd3+t细胞适宜使用rpmi1640(含10％fbs+2％青、链霉素)作为培养基，在37℃，5％co2下培养。

37、4.将分选后的t细胞与事先使用肠炎沙门菌(c50041)及鸡白痢沙门菌(c79/13)感染过的巨噬细胞进行共培养，72h后检测t细胞的细胞因子情况。

38、有益效果

39、本专利通过流式分选获得高纯度细胞，并在保证高纯度t细胞的前提下优化了单独培养鸡t淋巴细胞的条件，使其死亡率显著降低并节约培养成本；并成功将其应用于沙门菌感染后的细胞共培养，采用本发明方法可以得到更高纯度的细胞，且细胞死亡率更低。目前鲜有报道关于流式分选后鸡原代细胞培养条件的建立，本发明能为培养分选后鸡原代细胞的方法提供依据。