一种利用标签制备多肽的方法

本发明属于基因工程及多肽制备方法，具体涉及一种利用标签制备多肽的方法。

背景技术：

1、蛋白质的制备是生物医药基础研究中必不可少的一部分，可以通过基因重组技术构建质粒载体，利用助融合标签来辅助蛋白质的表达和纯化。一般常用的辅助蛋白质表达的体系有大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞，其中大肠杆菌蛋白质表达系统具有成本低，培养简单，操作方便的优点，被广泛用于工业生产领域。

2、多肽具有序列短、无结构的特点，且部分多肽具有疏水性强的特点，利用助溶标签辅助疏水性强的多肽蛋白质表达是目前常用的策略，可以增强蛋白质的稳定性、提高其溶解性、实现其纯化。但部分多肽进行表达和纯化时，一端连接标签如thioredoxina(trxa)、gst、mbp、sumo、nusa和dsba，依然会出现在蛋白质表达系统中易降解的问题。另外，制备有抗菌活性的多肽如抗菌肽时，会出现诱导表达后多肽蛋白裂解宿主细菌的问题，导致多肽蛋白的表达量低。因此，急需一种制备多肽的方法，解决多肽在表达系统中表达量低、易降解的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的提供一种利用标签制备多肽的方法，应用该方法制备多肽时多肽不易降解，可以提高多肽的表达量。

2、本发明提供了一种利用标签制备多肽的方法，包括以下步骤：

3、将编码融合蛋白的基因表达后得到多肽；所述融合蛋白的氨基酸序列自n端到c端顺次包括标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签；

4、所述c端和n端的标签可以相同也可以不同；

5、所述多肽两端的酶切位点可以相同也可以不同。

6、优选的，所述标签包括thioredoxina、gst、mbp、sumo、nusa和dsba中的一种或两种。

7、优选的，所述融合蛋白还连接有用于纯化的第二标签；所述第二标签不插入在多肽和酶切位点之间；所述酶切位点包括肠激酶酶切位点、凝血酶酶切位点、xa因子酶切位点、烟草蚀纹病毒酶切位点、sumo蛋白酶酶切位点和hrv 3c蛋白酶酶切位点中的一种或两种。

8、优选的，所述第二标签的数量为一个以上；

9、所述融合蛋白的氨基酸序列自n端到c端顺次包括标签-第二标签-酶切位点-多肽-酶切位点-第二标签-标签；或者，标签-酶切位点-多肽-酶切位点-第二标签-标签；或者，标签-第二标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签；或者，第二标签-标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签-第二标签；或者，标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签-第二标签；或者，第二标签-标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签。

10、优选的，所述多肽包括易降解多肽或高毒性抗菌多肽。

11、优选的，所述高毒性抗菌多肽包括a3k/l7k-lah4；所述a3k/l7k-lah4的氨基酸序列如seq id no.1所示。

12、优选的，靠近c端的酶切位点包括肠激酶酶切位点或凝血酶酶切位点；靠近n端的酶切位点包括肠激酶酶切位点或凝血酶酶切位点。

13、优选的，所述易降解多肽包括fp；所述fp的氨基酸序列如seq id no.2所示。

14、优选的，酶切位点包括凝血酶酶切位点。

15、优选的，所述编码融合蛋白的核苷酸序列与载体连接后表达，所述载体包括pet-32a(+)。

16、本发明的有益效果：本发明提供了一种利用标签制备多肽的方法，包括以下步骤：将编码融合蛋白的基因表达后得到多肽；所述融合蛋白的氨基酸序列自n端到c端顺次包括标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签；所述n端和c端的标签可以相同也可以不同；所述多肽两端的酶切位点可以相同也可以不同。

17、本发明通过基因重组技术，在多肽氨基酸序列的c端和n端分别加上一个编码标签的基因序列，通过两端添加编码标签的基因序列将多肽包裹住，从而抑制多肽自身的降解，使易降解的多肽被稳定地表达纯化，如果多肽为抗菌活性多肽，包裹后还可以减弱抗菌活性多肽对表达宿主的毒性，使多肽在宿主中被稳定地表达纯化，从而实现多肽的有效制备。之后，再利用酶切位点将标签酶切去除，使多肽易于纯化。

技术特征：

1.一种利用标签制备多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标签包括thioredoxina、gst、mbp、sumo、nusa和dsba中的一种或两种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白还连接有用于纯化的第二标签；所述第二标签不插入在多肽和酶切位点之间；所述酶切位点包括肠激酶酶切位点、凝血酶酶切位点、xa因子酶切位点、烟草蚀纹病毒酶切位点、sumo蛋白酶酶切位点和hrv3c蛋白酶酶切位点中的一种或两种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二标签的数量为一个以上；

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽包括易降解多肽或高毒性抗菌多肽。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高毒性抗菌多肽包括a3k/l7k-lah4；所述a3k/l7k-lah4的氨基酸序列如seq id no.1所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，靠近c端的酶切位点包括肠激酶酶切位点或凝血酶酶切位点；靠近n端的酶切位点包括肠激酶酶切位点或凝血酶酶切位点。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述易降解多肽包括fp；所述fp的氨基酸序列如seq id no.2所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，酶切位点包括凝血酶酶切位点。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码融合蛋白的核苷酸序列与载体连接后表达，所述载体包括pet-32a。

技术总结
本发明属于基因工程及多肽制备方法技术领域，具体涉及一种利用标签制备多肽的方法。本发明提供了一种利用标签制备多肽的方法，包括以下步骤：将编码融合蛋白的基因表达后得到多肽；所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次包括标签‑酶切位点‑多肽‑酶切位点‑标签；所述C端和N端的标签可以相同也可以不同；所述多肽两端的酶切位点可以相同也可以不同。本发明的技术方案可以抑制多肽自身的降解，降低多肽对宿主细胞的毒性和表达宿主的死亡率，使多肽被稳定地表达纯化，从而实现多肽的有效制备。

技术研发人员：王申林,任琼琼,桑美惠,樊泽军,赵晓丽,汉蓉,张立新,马常兴
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13