一种内切多聚半乳糖醛酸酶及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于生物，涉及一种内切多聚半乳糖醛酸酶及其编码基因和应用。

背景技术：

1、植物细胞壁的主要成分是多糖，主要包括纤维素、果胶质和半纤维素等。果胶质属于多糖衍生物，烤烟烟叶中果胶含量一般可达6％～7％。果胶质在燃吸过程中可产生甲醇，进一步氧化为甲醛和甲酸等成分，给烟气带来刺激性，同时会导致卷烟焦油量升高，对烟草吸味及安全性不利。因此，烟草中的果胶含量已成为评价烟草品质的指标之一。在烟叶调制发酵和加工等过程中，一般应尽可能创造条件使果胶降解。

2、果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成的多糖链，果胶酶是指能协同分解果胶质的一组酶的总称，主要包括果胶裂解酶(pl)、聚半乳糖醛酸酶(pg)和果胶酯酶(pe)等，其广泛应用于造纸、食品、饲料和纺织等行业中。许多霉菌及少量的细菌和酵母菌都可产生果胶酶，如cn103194399a公开了一种产果胶酶微生物菌株及其在烟草中的应用；主要以曲霉和杆菌属细菌为主，另外还有扩展青霉、意大利青霉、白绢菌、立枯丝核菌、微小毛霉、高大毛霉、热解糖梭菌、匐枝根霉、出芽短梗霉和粗糙链孢霉等都报道有果胶酶的产生。市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉，一般认为黑曲霉属的代谢产物是安全的。另外一些杆菌属细菌的碱性果胶酶也受到一定重视，如浸麻芽孢杆菌等，随着分子生物技术的不断提高，常采用基因克隆技术对果胶酶进行异源表达。

3、综上所述，挖掘新型的果胶降解酶对于烟草纸草等领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种内切多聚半乳糖醛酸酶及其编码基因和应用，本发明首次从青霉中挖掘得到一种内切多聚半乳糖醛酸酶，具有果胶酶活性，可应用于烟草等生物材料的果胶降解等。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种内切多聚半乳糖醛酸酶，所述内切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列包括：

4、(1)seq id no.1或seq id no.2所示的序列，或，

5、(2)由如(1)所述序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且与(1)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列，或，

6、(3)与(1)或(2)所述序列具有至少90％序列同源性，且与(1)所述序列功能相同或相似的氨基酸序列。

7、本发明中，首次从青霉中挖掘得到一种内切多聚半乳糖醛酸酶，具有果胶酶活性，可应用于烟草等生物材料的果胶降解等。

8、可以理解，本技术发现一种具备降解果胶的功能酶(endo-pg蛋白，氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示)，那么相近菌株中的序列及功能与seq id no.1或seq idno.2所示序列相同或相似的酶均能预期其具备降解果胶的功能，此外，利用本领域通用技术手段对seq id no.1或seq id no.2所示序列进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基改造而获得的酶，同时功能与原蛋白相同或相似，亦可预期其具备降解果胶的功能。

9、seq id no.1：

10、mrsfiglaglavfssvalaapapavtapatlenraasctfsgsngaasasksktscstivlssvavpsgttldltglnsgtkvifegtttfgykewsgplvsvsgtditvegasgavldgdgarwwdgkgsnggktkpkffyahnlksssinnikilnspvqvfsingadtltldhitidnsdgdsagghntdafdvgssngvtisnanvqnqddclavnsgtniiftggtcsgghglsigsvggrsdntvdtvhiensniknsqngvriktvydatgsvsgvtyknitlsgitkygivieqdyengsptgtpttgvpitgltidgvtgsvtssatdvyilcgkgscsnwtwegvsitggkkstgcknipsgasc。

11、seq id no.2：

12、efapapavtapatlenraasctfsgsngaasasksktscstivlssvavpsgttldltglnsgtkvifegtttfgykewsgplvsvsgtditvegasgavldgdgarwwdgkgsnggktkpkffyahnlksssinnikilnspvqvfsingadtltldhitidnsdgdsagghntdafdvgssngvtisnanvqnqddclavnsgtniiftggtcsgghglsigsvggrsdntvdtvhiensniknsqngvriktvydatgsvsgvtyknitlsgitkygivieqdyengsptgtpttgvpitgltidgvtgsvtssatdvyilcgkgscsnwtwegvsitggkkstgcknipsgaschhhhhh。

13、可以理解，为使endo-pg蛋白便于分泌表达和纯化，可在seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端6×his标签(hhhhhh)，endo-pg可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

14、第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子含有第一方面所述的内切多聚半乳糖醛酸酶的编码基因。

15、优选地，所述编码基因的核酸序列包括seq id no.3所示的序列。

16、seq id no.3：

17、atgcgttccttcatcggccttgccggactggccgttttctcctcggtggcattggccgcgccagccccagctgttacagcaccagctacgctcgagaaccgtgccgcttcatgcacattctctggctccaacggtgctgcttcagccagcaagtccaagacttcgtgctcgaccatcgtattgtcgagcgttgctgtgccgtctggaaccacacttgacttgaccggtctcaactccggaaccaaggtcatcttcgaaggcaccaccaccttcggctacaaagaatggtccggccccctcgtctccgtctctggaaccgacatcaccgtcgaaggagcctctggcgccgttttggacggtgacggtgcccgctggtgggacggcaagggcagcaacggcggcaagaccaagcccaagttcttctatgctcacaatctcaagtcatcttctatcaacaacatcaagatcctgaactcccccgtacaggttttcagcattaacggtgccgacactctcactctcgatcatatcacgattgataactcggacggtgattctgcgggtggtcacaacactgatgcgtttgatgttggtagttcgaatggggttactatctcgaatgccaatgtgcagaatcaggatgattgtttggctgttaactctggcactaacatcatcttcaccggtggtacctgctccggtggccatggcttgtccattggatccgtaggaggccgttccgacaacaccgtcgacaccgtccacattgagaactccaatatcaagaactcccaaaatggcgtccgcatcaagaccgtctacgatgccaccggctccgtctccggcgtaacctacaagaacatcaccctctccggcatcaccaaatatggcatcgtcattgagcaggactatgagaacggcagccctaccggcacacccaccaccggcgtccctattaccggtcttaccatcgatggtgttacaggtagcgtcactagctctgctaccgatgtctacatcctgtgtggtaaaggtagctgctctaactggacttgggagggtgtttctattaccggtggaaagaagagcaccggctgcaagaacattcctagcggtgctagctgctaa。

18、可以理解，如下a、b、c和d的dna分子均适用于本发明：

19、a编码序列是seq id no.3自5’端第1至1128位核苷酸所示的dna分子；

20、b编码序列是seq id no.3所示的dna分子；

21、c在严格条件下与a或b限定的dna序列杂交且编码相同蛋白的dna分子；

22、d与a或b或c限定的dna序列具有90％以上同源性，且编码具有果胶酶活性的蛋白的dna分子。

23、第三方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。

24、本发明中，所述重组载体具体可为将所述核酸分子插入ppiczaa质粒或者其它表达质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

25、第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的重组载体。

26、第五方面，本发明提供一种第一方面所述的内切多聚半乳糖醛酸酶的制备方法，所述方法包括：

27、将第一方面所述的内切多聚半乳糖醛酸酶的编码基因插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，进行培养，得到所述内切多聚半乳糖醛酸酶。

28、优选地，所述宿主细胞包括酵母菌。

29、第六方面，本发明提供一种基因表达盒，所述基因表达盒含有第二方面所述的核酸分子。

30、第七方面，本发明提供第一方面所述的内切多聚半乳糖醛酸酶、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的重组细胞或第六方面所述的基因表达盒在制备果胶和/或多聚半乳糖醛酸聚糖中降解产品中的应用。

31、第八方面，本发明提供第一方面所述的内切多聚半乳糖醛酸酶、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的重组细胞或第六方面所述的基因表达盒在降解果胶和/或多聚半乳糖醛酸聚糖中的应用。

32、第九方面，本发明提供一种降解果胶和/或多聚半乳糖醛酸聚糖的方法，所述方法包括：

33、将果胶和/或多聚半乳糖醛酸聚糖与第一方面所述的内切多聚半乳糖醛酸酶混合，进行降解反应。

34、优选地，所述降解反应的温度为40℃～50℃，包括但不限于41℃、42℃、45℃、46℃、47℃、48℃或49℃，ph为5～7。

35、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

36、本发明首次从青霉中挖掘得到一种具有果胶降解功能的酶，并分析其核酸及氨基酸序列，实现了在酵母中的高效表达，酶活最高达到6.95u/ml可有效进行可应用于烟草等生物材料的果胶降解等领域中。