林蛙特异性序列、引物及利用其鉴定林蛙或林蛙油的方法

本发明属于生物，具体涉及林蛙特异性序列、引物及利用其鉴定林蛙或林蛙油的方法。

背景技术：

1、林蛙俗称“哈士蟆”，不仅能大量捕食森林、牧草和农作物的害虫，而且是中国药、肉兼用的蛙类，因而林蛙是中国的重要经济动物之一。东北林蛙的整体或雌蛙输卵管的干制品，均可入药，即称哈士蟆和哈士蟆油，是中国传统的名贵中药材之一。一般用作滋补强身，治疗体弱气虚、神经衰弱、病后失调等病症。林蛙油作为传统而名贵的中药材，因其价格高昂，市场上同属和混伪品较多，因此，林蛙油的真伪鉴别更加的重要。传统的林蛙油鉴别方法主要是来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定，这些以形态学为基础的鉴别方法简便、易行，是行之有效的林蛙油鉴别方法。但这些鉴别方法是以林蛙油的遗传表现型为基础而建立起来的，不仅受到遗传因素的影响，而且与中国林蛙的生长发育阶段、自然环境及人类活动等有着密切的关系，其遗传表现型的变异性较大，同时在鉴别过程中容易受主观因素的影响，存在重复性和稳定性较差等问题，从而影响鉴定结果的可靠性。相比之下，利用dna分子特征作为遗传标记进行中药鉴定更为准确可靠，非常适用于由近缘物种、易混淆物种、珍稀物种等获得的中药药材的鉴定。因此，寻找林蛙的dna分子特征对于林蛙油的鉴定具有重要意义。

技术实现思路

1、为了准确鉴定林蛙或林蛙油，本发明提供了林蛙具有的特异性序列、用于扩增该特异性序列部分片段的引物对及利用该引物对鉴定林蛙或/和林蛙油的方法。

2、本发明的第一个目的是提供一种林蛙特异性序列coi，所述林蛙特异性序列coi的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明的第二个目的是提供上述林蛙特异性序列coi在鉴定林蛙中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供上述林蛙特异性序列coi在鉴定林蛙油中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种用于扩增上述林蛙特异性序列coi中部分片段的引物对，所述引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

6、本发明的第五个目的是提供上述引物对在鉴定林蛙中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供上述引物对在鉴定林蛙油中的应用。

8、本发明的第七个目的是提供一种利用pcr鉴定林蛙的方法，所述方法为提取蛙油dna，以蛙油dna为模板，进行pcr扩增，若pcr结果显示240bp处具有明亮的单一条带，则判断样本为林蛙；所述pcr扩增所用引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

9、在本发明的一种实施方式中，所述提取蛙油dna的方法包括如下步骤：

10、(1)取10mg蛙油打碎处理为悬液，离心，弃上清，加入200μl缓冲液ga，振荡至完全悬浮，加入20μl蛋白酶k，混匀，于56℃静止3h，每小时颠倒2～3次；

11、(2)加入200μl缓冲液gb，充分混匀后，70℃放置10min；

12、(3)加入200μl无水乙醇，振荡15s；

13、(4)将所得液体加入吸附柱中，离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

14、(5)向吸附柱中加入200μl缓冲液gd，离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

15、(6)向吸附柱中加入600μl漂洗液，离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中，并重复操作一次；

16、(7)吸附柱及收集管离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中，至于室温5min；

17、(8)将吸附柱转移至干净的离心管内，向吸附膜中间悬空滴加100μl缓冲液，室温放置3min，离心，将溶液收集到离心管内，得到dna。

18、在本发明的一种实施方式中，上述pcr扩增的体系为2×es taq master mix 10.0μl，上下游引物各1μl，dna模板4μl，ddh2o 4μl。

19、在本发明的一种实施方式中，上述pcr扩增的程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃2min。

20、本发明的第八个目的是提供一种利用pcr鉴定林蛙油的方法，所述方法为提取蛙油dna，以蛙油dna为模板，进行pcr扩增，若pcr结果显示240bp处具有明亮的单一条带，则判断样本为林蛙油；所述pcr扩增所用引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

21、在本发明的一种实施方式中，所述提取蛙油dna的方法包括如下步骤：

22、(8)取10mg蛙油打碎处理为悬液，离心，弃上清，加入200μl缓冲液ga，振荡至完全悬浮，加入20μl蛋白酶k，混匀，于56℃静止3h，每小时颠倒2～3次；

23、(9)加入200μl缓冲液gb，充分混匀后，70℃放置10min；

24、(10)加入200μl无水乙醇，振荡15s；

25、(11)将所得液体加入吸附柱中，离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

26、(12)向吸附柱中加入200μl缓冲液gd，离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

27、(13)向吸附柱中加入600μl漂洗液，离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中，并重复操作一次；

28、(14)吸附柱及收集管离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中，至于室温5min；

29、(8)将吸附柱转移至干净的离心管内，向吸附膜中间悬空滴加100μl缓冲液，室温放置3min，离心，将溶液收集到离心管内，得到dna。

30、在本发明的一种实施方式中，上述pcr扩增的体系为2×es taq master mix 10.0μl，上下游引物各1μl，dna模板4μl，ddh2o 4μl。

31、在本发明的一种实施方式中，上述pcr扩增的程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃2min。

技术特征：

1.一种林蛙特异性序列coi，其特征在于，所述林蛙特异性序列coi的核苷酸序列如seqid no.1所示。

2.权利要求1所述林蛙特异性序列coi在鉴定林蛙中的应用。

3.权利要求1所述林蛙特异性序列coi在鉴定林蛙油中的应用。

4.一种用于扩增权利要求1所述林蛙特异性序列coi中部分片段的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，下游引物核苷酸序列如seq idno.3所示。

5.权利要求4所述引物对在鉴定林蛙中的应用。

6.权利要求4所述引物对在鉴定林蛙油中的应用。

7.一种利用pcr鉴定林蛙的方法，其特征在于，所述方法为提取蛙油dna，以蛙油dna为模板，进行pcr扩增，若pcr结果显示240bp处具有明亮的单一条带，则判断样本为林蛙；所述pcr扩增所用引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

8.一种利用pcr鉴定林蛙油的方法，其特征在于，所述方法为提取蛙油dna，以蛙油dna为模板，进行pcr扩增，若pcr结果显示240bp处具有明亮的单一条带，则判断样本为林蛙油；所述pcr扩增所用引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

9.根据权利要求7或8任意一项所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的体系为2×estaqmastermix10.0μl，上下游引物各1μl，dna模板4μl，ddh2o4μl。

10.根据权利要求7或8任意一项所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃2min。

技术总结
林蛙特异性序列、引物及利用其鉴定林蛙或林蛙油的方法，属于生物技术领域。本发明为了准确鉴定林蛙油和林蛙，提供了林蛙具有的特异性序列、用于扩增该特异性序列部分片段的引物对及利用该引物对鉴定林蛙或林蛙油的方法，具体涉及以蛙油DNA为模板，使用林蛙特异性引物进行PCR，对PCR产物进行凝胶电泳，根据凝胶电泳在240bp处是否有条带判断是否为林蛙油样品。本发明所述的特异性序列、用于扩增该特异性序列部分片段的引物对可用于林蛙或林蛙油的鉴定，本发明所述的利用该引物对鉴定林蛙油的方法能够从林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油等不同种类蛙油中鉴别出林蛙油，也能从不同蛙种中鉴定处林蛙。

技术研发人员：彭英华,郭佳,陈泽,庞鑫,孙泽鹏
受保护的技术使用者：中国农业科学院特产研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13