一种基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法与流程

本发明涉及核酸检测，具体地涉及一种基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法。

背景技术：

1、在癌症液体活检的临床样本中，dna的改变为疾病的诊断和治疗提供了重要线索。如何灵敏的、准确的检出这些突变型dna序列，在生物学、生物技术和医学的几个领域构成了持续的技术挑战。

2、目前存在下述问题：

3、1.发生改变的突变型dna序列，通常存在于正常野生型dna中，且突变型dna丰度普遍较低，尤其是在血液循环肿瘤dna中，95％以上的cfdna来源于正常的白细胞，从几千条序列中，寻找几十个突变的序列，灵敏度是难以保证的。

4、2.在实验过程、高通量测序过程中，需要进行多轮的pcr，pcr聚合酶的错误合成，会引入低频的、假的突变型dna序列，与真实的低频突变难以区分。虽然可以通过分子标签技术来解决，但是这需要对目标区域进行大量的、过量的测序，同时大量的测序数据都是测到的野生型dna，影响了低频突变的检出率，同时也浪费了测序通量。

5、3.现有方法有的是使用序列特异性的酶去进行野生型片段的去除，但由于这种酶只特异性的识别某些序列特征，导致它们的应用范围是受限的。

6、4.虽然现在的一些技术可以较好的检测低频突变，比如数字微滴pcr，但是检测的通量以及样本量是受限的，无法高通量的进行大量目标基因和突变的同时检测。

7、在液体活检样品的基因检测中，野生型dna对于突变型dna来说，会影响突变检出灵敏度和准确性，真实的信号会淹没在大量背景噪音中，为了检测到低频突变型dna，需要大量的深度测序数据，即使这些数据大部分都检测到了野生型dna。开发一种有效的实验方法结合生信分析优化，将这些低频突变更加灵敏的、准确的检测出来，是现在液体活检基因检测越来越迫切的需求。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的技术问题，发明人进行了深入研究，提出一种基因目标位点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，该方法对突变型dna不产生影响，同时不仅可以更加准确的检出低频突变，也可以大大降低测序数据量。具体地，本发明包括以下内容。

2、本发明提供一种基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其包括以下步骤：

3、(1)使生物样本中的dna解链，然后使解链后的dna在适于在杂交的条件下与探针组杂交，使探针组中的各探针与解链后的dna形成双链结构，其中，所述探针组中各探针设计为在低于探针组中各探针tm平均值5℃内的温度下能够与目标区域完全互补，但不会使解链后的dna退火；

4、(2)向含双链结构的溶液中加入双链特异性酶并保持于所述温度进行反应；

5、(3)富集步骤(2)得到的dna；

6、(4)将步骤(3)扩增后的产物进行末端修复、连接测序接头，进一步构建测序文库后进行高通量测序。

7、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其中，所述探针组中各探针长度为10-25个碱基。

8、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其中，所述探针tm平均值为56℃-60℃。

9、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其中，所述探针组中各探针gc含量为60-80％。

10、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其中，所述富集包括：在同一pcr反应体系中加入两对以上的不同引物，扩增dna的核酸片段，其中所述引物tm值为57-62℃。

11、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其中，扩增循环数为18-24个循环。

12、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其中，所述单点降噪中目标区域包括下述基因中的至少一种：akt1、dhfr、idh2、pdgfra、esr1、alk、dpyd、kit、pik3ca、ntrk1、braf、egfr、kras、ros1、ntrk3、cda、erbb2、map2k1、rrm1、tert、cyp19a1、ercc1、mdr1(abcb1)、smad4、ugt1a1*28、cyp2c19、ercc2、met、smo、slc19a1、cyp2c8、gstp1、mthfr、tp53、ggh、cyp2c9、her2、notch1、tsc1、cyp2d6、hras、nqo1、ugt1a1、cyp3a4、idh1、nras和xrcc1。

13、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其中，单个探针的浓度为20-180nm，所述探针组的总浓度为0.5-2μm。

14、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其中，双链特异性酶浓度为0.2u-1u。

15、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于单点降噪结合靶向高通量测序的检测方法，其中，所述探针的序列包括seq id no.:1-8所示的序列，所述引物序列包括seq idno.:9-20所示的序列。

16、本发明采用了双链特异性酶(dsn酶)处理原始dna样本，这种酶会特异性的切割完全互补的短双链dna，而对有变异无法完全配对的序列没有或很低的切割活性。根据这种特性，本发明针对特异的位点设计了和野生型dna序列完全互补的探针，探针长度在25bp左右，在进行变性退火后，dsn酶会优先的去切割与探针完全互补的野生型dna序列，而突变型dna序列由于与探针不完全互补，同时丰度较低复性速度较慢，而不被dsn酶切割，进而被相对完整的保留了下来。根据实际实验结果，本发明对不同的设计目标基因位点检测，结果表明突变型都得到了不同程度的富集。

17、此外，本发明对探针的设计以及投入量进行摸索，最终发现在10ng dna起始量的情况下，设计了探针的突变位点突变频率比富集前提高了10-60倍，相比之下，未设计探针的突变位点突变频率没有明显变化。因此，本发明的方法尤其适合于肿瘤cfdna中低频ctdna突变的检测，根据本发明的方法，可以针对明确的监控位点设计探针后，进行目标位点的降噪后再靶向富集后进行测序。

18、本发明的技术效果包括：

19、(1)适配性好：由于是对原始样本的dna进行探针杂交+双链特异性酶处理，所以不影响后续的成熟的实验流程，无需新的适配的流程开发；

20、(2)样本起始量低：本发明对起始的样本量进行了摸索，发现该方法在10ng的起始量的情况下依然可以稳定的对突变型dna有10-60倍的富集，从而对cfdna样本进行检测；

21、(3)探针设计：考虑到双链特异性酶的特性是对于完全互补的、较短的双链dna是切割效率比较高的，因此本发明设计的探针较短(25nt左右)。同时为了防止探针的3’端进行延伸，本发明在3’端进行了磷酸化，可以阻止碱基的结合，进而阻止延伸；

22、(4)探针的投入量：探针的投入量过少野生型dna去除效果差，探针投入量过多不仅野生型会大量被切割，突变型dna也会被少量的切割，所以合适的探针投入量是本发明需要确定的，在低样本起始量，如10ngdna投入的情况下，单条探针的工作浓度在20-180nm之间，总探针的工作浓度在0.5-2μm之间，是优选的探针投入量。

23、(5)pcr扩增循环数：在样本的野生型dna去除后，后续的多重pcr扩增循环数也是重要的实验参数，扩增循环数过少，会导致进行降噪的位点，覆盖深度会比较差(＜50x)，扩增循环数过多，由于扩增的偏好性，更倾向于扩增丰度相对较高的野生型dna，导致测序结果中的富集效果偏差。