一种基于CRISPR核酸检测系统的高效抗病毒靶点筛选技术及其应用

本发明属于基因突变和基因工程，具体涉及一种基于crispr核酸检测系统的高效抗病毒靶点筛选技术及其应用。

背景技术：

1、流行性感冒，简称流感，是由流感病毒(influenza virus)引起的一种急性呼吸道传染病。全球性的流感大流行危害尤为严重，每年约数十万人死于流感及其导致的并发症，而主要造成感染和死亡的病毒为甲型流感病毒(influenza a virus,iav)。iav极易变异，亚型众多并且能够跨越动物-人类宿主物种屏障，曾引起多次流感大流行，给人类健康问题带来严重威胁。目前流感的预防主要依靠流感疫苗的接种，由于流感病毒易发生抗原漂移以及抗原转换，疫苗保护效力具有很强的时效性。近年来研究人员开发出了一系列高效的抗流感病毒药物，然而随着流感病毒逐年的变异以及耐药株的出现，抗流感病毒药物的研发面临严峻的挑战。因此，建立一种可有效应对病毒变异及耐药突变的抗病毒药物快速研发平台势在必行。

2、近年来，crispr基因编辑技术迅猛发展，基于crispr/cas9系统的基因编辑技术作为一种高效可编程的基因改造工具已在医学、生物学、农业等领域被广泛用于科学研究、基因治疗以及动植物育种等研究。2017年，研究人员发现了可以靶向rna的crispr/cas13系统并将其应用于核酸检测、rna编辑以及抗病毒等领域。在抗病毒方面，目前研究人员已在细胞及体内利用crispr/cas13技术实现对多种rna病毒的高效抑制。研究结果表明，该技术不仅具有可编程、高效、低脱靶等优势，还可同时靶向多种病毒亚型以防止耐药株的逃逸。然而现有crispr/cas13系统抗病毒技术在筛选靶点时过程繁琐且耗时长、成本高，限制了高效抗病毒靶点的筛选及技术的推广应用。考虑到crispr/cas13系统已被开发为一种高灵敏、高特异、高通量的体外核酸检测技术，而其在体外的核酸检测原理与细胞内抗病毒原理类似，均依赖于crrna与cas蛋白和目标核酸的特异性结合并激活cas13蛋白rna酶活性的能力，为了进一步推动crispr/cas13a系统在抗病毒领域的应用，因此，本研究以流感病毒为例，旨在建立一种基于crispr/cas13a核酸检测系统的抗流感病毒crrna靶点高效筛选技术，筛选出具有高效抗流感病毒活性的crrna，同时为基于crispr/cas13a系统的可编程抗病毒靶点筛选提供新策略。

技术实现思路

1、基于现有技术存在的问题，本发明提供一种用于检测甲型流感病毒基因的crispr-cas13a系统；

2、所述用于检测甲型流感病毒各区段的crispr-cas13a系统包括如下a1)-a2)；

3、a1)rt-pcr引物对和crrna；

4、所述rt-pcr引物对、crrna的靶点序列如表1、表3、表8，

5、表3、表8中序列第1-38位均为用于与cas13a蛋白结合的锚定序列；第39-66位均为靶向甲型流感病毒各区段靶点序列的向导序列。

6、用于扩增待测样本靶点序列的rt-pcr扩增引物，且所述rt-pcr扩增引物中的一条引物的5'末端具有被t7 rna聚合酶识别的区域；

7、a2)crrna和lwcas13a蛋白，或crrna和lwcas13a蛋白复合体；

8、所述crrna包括用于与cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向甲型流感病毒位点靶点序列的向导序列；

9、所述靶点序列位于分别位于甲型h1n1流感病毒编码pa(genbank id：nc_002022.1)、pb1(genbank id：nc_002021.1)、pb2(genbank id：nc_002023.1)、np(genbankid：nc_002019.1)、ns(genbank id：nc_002020.1)蛋白的序列上；

10、所述crrna序列如表6、表9所示。

11、上述crispr-cas13a系统中，所述cas13a蛋白为lwcas13a蛋白。

12、本发明第二个目的是提供一种抑制流感病毒的crispr-cas13a系统。

13、本发明提供的crispr-cas13a系统，包括cas13a蛋白和靶向甲型流感病毒的靶点对应的crrna，或二者形成的复合体；

14、上述crispr-cas13a系统中，所述甲型流感病毒的各基因靶点为序列30-34。

15、进一步的提供相应的应用：

16、上述的系统在制备抑制流感病毒产品中的应用；

17、上述crispr-cas13a系统在制备降低流感病毒载量产品中的应用；

18、上述crispr-cas13a系统在制备流感病毒疫苗中的应用；上述crispr-cas13a系统在制备抗流感病毒产品中的应用；

19、本发明第三个目的是提供一种rna片段。

20、本发明提供的rna片段，其核苷酸序列为序列表中序列1-29。

21、本发明第四个目的是提供多种应用；

22、如上述rna片段在制备抑制流感病毒产品中的应用；

23、或上述rna片段在制备降低流感病毒载量产品中的应用；

24、或上述rna片段在制备流感病毒疫苗中的应用；

25、或上述rna片段在制备抗流感病毒产品中的应用；

26、上述rna片段和cas13a蛋白或二者形成的复合体在如下中的应用：

27、1)制备抑制甲型h1n1流感病毒复制的产品；

28、2)制备降低甲型h1n1流感病毒载量产品；

29、3)制备甲型h1n1流感病毒疫苗；

30、4)制备抗甲型h1n1流感病毒产品。

31、上述中，所述产品为试剂盒或药物。

32、本发明第五个目的是提供一种基于crispr/cas13a核酸检测系统的抗病毒crrna靶点高效筛选方法；

33、所述一种基于crispr/cas13a核酸检测系统的抗病毒crrna靶点高效筛选方法，其特征在于，其包含以下步骤：

34、(1)设计crrna和pcr引物；

35、(2)利用rt-rcr技术对目标核酸进行扩增，将目标病毒检测的靶点序列转录得到相应的ssrna，用步骤(1)的crrna进行检测，比较不同crrna的信号强弱，选择荧光信号较强且灵敏度高的crrna；

36、(3)将步骤(1)的crrna用于病毒感染和crispr-cas13a系统转染，在感染后第2天收集细胞；定量rt-pcr检测细胞中的病毒载量；筛选crrna；

37、(4)通过分析步骤(2)以及步骤(3)中分别筛选到的crrna间的对应关系，建立了基于crispr核酸检测系统的高效抗病毒靶点筛选方法。

38、优选的，所述步骤(4)包括如下步骤：

39、(4.1)crrna靶点的统计学分析

40、将步骤(2)以及步骤(3)中筛选到的有效crrna进行统计学分析：通过crispr-cas13a核酸检测筛选出的11种crrna，pa-2、pa-6、pb1-2、pb1-3、np-4、pb2-1、pb2-2、pb2-3、pb24、pb2-5、pb2-6，可能对细胞中的抗病毒有效。因此，通过crispr-cas13a核酸检测筛选的crrna的抗病毒有效性为100％；

41、(4.2)crrna靶点的相关性分析

42、将步骤(2)以及步骤(3)中筛选到的crrna荧光值和病毒抑制率进行相关性分析：荧光值与病毒抑制率呈对数关系，对于91％的crrna，当crispr-cas13a核酸检测的最大荧光值大于0.2a.u.时，病毒抑制率大于60％。

43、本发明第六个目的是提供一种基于crispr核酸检测系统的高效抗病毒靶点筛选方法的应用；

44、所述的一种基于crispr核酸检测系统的高效抗病毒靶点筛选方法的应用，其特征在于，所述应用为多种病毒的抗病毒靶点筛选，任选地，所述病毒为甲型流感病毒。

45、优选地，其特征在于包含以下步骤：

46、(1)crispr核酸检测系统的crrna靶点筛选；

47、(2)定量rt-pcr检测细胞中的病毒载量；

48、(3)tcid50实验试验确定cas13a/crrna抑制甲型流感病毒的复制的效果；

49、(4)空斑试验确定cas13a/crrna可以抑制甲型流感病毒的复制的效果。

50、本发明第七个目的是提供一种产品；

51、所述一种产品，其特征在于，其包含能够实施权利要求11-15技术方案的试剂，和相应的使用说明书。

52、所述产品优选一种试剂盒。

53、与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果：

54、本发明的实验证明，本发明发现一种新的抗流感病毒靶点筛选方法，不同于传统靶点筛选方法，直接利用crispr体外检测技术进行靶点筛选，因此，具有速度快、效率高的特点，有助于crispr-cas13a抗病毒系统的快速发展。