引物探针组、检测产品及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物探针组、检测产品及其应用。

背景技术：

1、结核分枝杆菌(m.tuberculosis)简称为结核杆菌(tubercle bacilli)，是人类结核病的病原体。是专性需氧的一类细菌，抗酸染色阳性。无鞭毛，有菌毛，有微荚膜但不形成芽孢，其细菌壁既没有革兰阳性菌的磷壁酸，也没有革兰阴性菌的脂多糖。德国细菌学家郭霍(robert koch，1843-1910)于1882年发现并证明为人类结核病的病原菌。该菌感染人体导致的结核病是严重影响人类生命健康的一种传染病，经过与其几个世纪的抗争后逐渐得到控制，但近年来由于多种因素的影响，该疾病变得日趋严重。

2、由于结核分枝杆菌比较难破壁，其核酸提取效率最高只能达到40％左右，经提取这一步就大大的降低了结核分枝杆菌的检测灵敏度，目前市场上存在的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，为了提高检测效率在选用高拷贝序列is6110和is1081的同时，使用了巢式扩增。该方法确实大大的提高了结核分枝杆菌的检测灵敏度，但是其检测的靶标是dna。结核分枝杆菌只要存在过，无论死菌活菌都有dna的存在，故检测dna无法完全明确患者体内是否有活的结核分枝杆菌存在，该方法只能用于结核患者的筛查，不能用于患者的治疗监控。

3、同时，大量患者在使用药物以后，即使结核分枝杆菌全被杀死，但是体内仍有大量的结核分枝杆菌dna存在，导致选用高拷贝序列并使用巢式等以dna为靶标的方法检测仍然显示阳性结果。在治疗上为医生提供错误信息，引起过度治疗。

4、因此，寻找一种灵敏度高、特异性好，同时可以用于对结合患者药物治疗反应进行监测的试剂盒至关重要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了引物探针组、检测产品及其应用。本发明提出了将液滴数字pcr平台用来检测结核分枝杆或结核分枝杆菌复合群，本发明另一方面提出了将rrna结合is6110同时检测dna和rna作为核酸检测试剂盒的靶标。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了引物，具有：

4、(1)、如seq id no:1至seq id no:6中任意所示的核苷酸序列；或

5、(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

6、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

7、(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

8、本发明还提供了探针，具有：

9、(5)、如seq id no:7至seq id no:9中任意所示的核苷酸序列；或

10、(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

11、(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

12、(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

13、在本发明的一些实施方案中，上述探针具有荧光报告基团和/或淬灭基团。

14、在本发明的一些实施方案中，上述探针中所述荧光报告基团包括fam和/或vic，所述淬灭基团包括mgb和/或bhq1。

15、本发明还提供了引物探针组，包括上述引物和/或上述探针。

16、本发明还提供了上述引物、上述探针和/或上述引物探针组在制备检测结核分歧杆菌和/或结核分歧杆菌复合群的核酸的产品中的应用。

17、在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述结核分枝杆菌复合群包括：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌或非洲分枝杆菌。

18、在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述产品包括：检测试剂和/或试剂盒。

19、本发明还提供了检测产品，包括上述引物、上述探针和/或上述引物探针组以及可接受的助剂或载体。

20、在本发明的一些实施方案中，上述检测产品，以体积份数计，其反应体系包括：

21、

22、；所述引物探针混合液包括上述引物探针组。

23、在本发明的一些实施方案中，上述检测产品，以体积份数计，所述引物探针混合液包括：

24、上游引物 0.35份

25、下游引物 0.35份    探针 0.105份

26、；所述上游引物、所述下游引物或所述探针的初始浓度为100μm。

27、在本发明的一些实施方案中，上述检测产品的扩增程序包括：

28、

29、在本发明的一些实施方案中，上述检测产品适用于液滴数字pcr。

30、在本发明的一些实施方案中，上述检测产品包括检测试剂和/或试剂盒。

31、本发明还提供了检测方法，取上述引物、上述探针、上述引物探针组和/或如上述检测产品对待测样品扩增，检测。

32、在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中所述检测的检测靶标包括：rrna或is6110。

33、在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中所述待测样品包括结核分歧杆菌和/或结核分歧杆菌复合群。

34、本发明提供了引物，具有：

35、(1)、如seq id no:1至seq id no:6中任意所示的核苷酸序列；或

36、(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

37、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

38、(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

39、本发明的有益效果包括：

40、(1)本发明提出了将液滴数字pcr平台用来检测结核分枝杆或结核分枝杆菌复合群，本发明另一方面提出了将rrna结合is6110同时检测dna和rna作为核酸检测试剂盒的靶标。该试剂盒不仅灵敏度高、特异性好；同时，因其绝大部分的检测值是通过rrna反应出来的，还可以用于结核患者对药物治疗反应的监测。

41、(2)本发明选用核糖体rna(rrna)结合is6110为检测靶标。因为蛋白质是生命活动的体现者，核糖体是蛋白质的加工厂，所以无论是原核生物还是真核生物体内均含有大量的核糖体。所以检测rrna不仅能大大的提高检测靶标的拷贝数，提高检测的灵敏度；而且核糖体rna也不会像信使rna(mrna)一样，虽然检测的都是活菌，但是mrna与细胞的生命状态有关，不仅极容易降解，而且在不同的细胞也差异极大，就算是相同的细胞不同的时间测量差异也极其明显，导致检测极其不稳定。rrna是一种稳定的rna靶标，它的半衰期比mrna长相对来说比较稳定，比mrna丰度高，估计是mrna总量的100倍。特别适合用作结核分枝杆菌检测活菌的靶标。当患者使用药物以后，只要结核分枝杆菌被大量的杀死，检测值就会明显降低，可以及时反应治疗信息。同时保留了dna，结合数字pcr灵敏度高的特点，即使收集的样本未必能及时处理，或未严格按照rna样本保存的要求保存，仍然具有较高的灵敏度。