生物标志物在诊治SAH脑血管痉挛中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及生物标志物在诊治sah脑血管痉挛中的应用。

背景技术：

1、蛛网膜下腔出血(sah)是一种众所周知的神经急症，其特点是蛛网膜和软脑膜之间的蛛网膜下腔出血。研究数据证明，sah的总发病率为十万分之九，高达40％-45％的患者可能死于sah，而50％-66％的患者将遭受永久性残疾。sah的主要症状是突然的严重头痛，通常被描述为“生命中最严重的头痛”，并伴有短暂的意识丧失、恶心或呕吐、脑膜炎和癫痫发作。患有sah的患者还可能出现各种并发症，包括再出血、脑水肿、脑血管痉挛(cvs)和脑缺血。尽管由于蛛网膜下腔出血的发病率较低，其危险因素高度不确定，但最常见的风险因素包括女性、高血压、吸烟和颅内动脉瘤的流行和生长。尽管sah的发病率和死亡率在过去几十年中有所下降，但sah临床治疗的进一步进展缓慢，许多随机临床试验未能改善患者的预后。

2、微小核糖核酸(mirnas)是高度组织特异性的元件，不仅在细胞内发挥作用，而且在外泌体中递送到细胞外时仍保持功能，并且在体液中稳定存在。研究发现，mirnas的异常表达与癌症相关疾病、心血管疾病和一些神经疾病有关。检测样本中的mirna可以为蛛网膜下腔出血的研究提供有效的方法。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一种诊断sah脑血管痉挛的方法；

2、本发明的第二目的是提供一种治疗sah脑血管痉挛的方法；

3、本发明的第三目的是提供一种筛选治疗sah脑血管痉挛的药物的方法。

4、为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

5、本发明第一方面提供了一种检测受试者样本中基因标志物的表达水平的试剂，所述的基因标志物包括mir-130b、或klf4。

6、“基因标志物”也称为“生物标志物”或“分子标志物”，在本发明中三者可互换使用，基因标志物是指在患者或患者样本中的表达水平与正常或健康者、或来源于正常或健康者的样本中的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

7、基因标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。

8、在本发明中，术语“样本”是指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理、生化、化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。样本包括但不限于：组织样本、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳、血液、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰、泪、汗液、粘液、组织培养液、组织提取物如匀浆化的组织、细胞提取物及其组合。

9、进一步，所述的样本包括血液、活检组织、血清、血浆、尿、粪便、痰、脑脊液或来自细胞裂解物的上清液。

10、进一步，所述的样本为脑脊液。

11、进一步，所述的样本为组织，更进一步，所述的组织为脑基底动脉组织。

12、进一步，所述的受试者为哺乳动物，更进一步，所述的受试者为人、或鼠。

13、进一步，所述的试剂包括能够检测基因标志物的蛋白水平的试剂、或能够检测基因标志物的mrna水平的试剂。

14、进一步，所述的检测基因标志物的蛋白水平使用选自多重邻位延伸分析、酶联免疫吸附、放射免疫测定、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选、质谱分析、mrm测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定或蛋白质芯片测量中的任何一种或多种来进行。

15、进一步，所述的检测基因标志物的mrna水平使用选自聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、rna印迹或dna芯片的方法中的任何一种或多种来进行。

16、进一步，所述的试剂包括：

17、与所述基因标志物基因特异性结合的引物或探针；

18、或与所述基因标志物蛋白特异性结合的抗体、肽、适配体或化合物。

19、本文所使用的术语“引物”是指具有短游离3'-羟基的核酸序列，是可以与互补模板形成碱基对并充当模板链复制的起点的短核酸。在适当的缓冲溶液和温度下，在存在用于聚合的试剂(即dna聚合酶或逆转录酶)和四种不同的核苷三磷酸的情况下，引物可以引发dna合成。可以根据本领域已知的技术适当地选择pcr条件以及正义和反义引物的长度。

20、本文所使用的术语“探针”是指对应于可以特异性结合mrna的几个碱基至数百个碱基的核酸片段(例如rna或dna)，并且可以通过标签来确认特定mrna的存在与否以及表达水平。探针可以以寡核苷酸探针、单链dna探针、双链dna探针或rna探针的形式制备。可以根据本领域已知的技术适当地选择合适的探针和杂交条件。

21、本文所使用的术语“抗体”是本领域众所周知的，是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。本发明中的抗体是指与本发明的基因标志物蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常规方法来制造抗体。抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段(诸如fab、fab'、f(ab')2和fv片段)、单链fv(scfv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性。

22、本文所使用的术语“肽”具有与靶物质高度结合的能力，并且在热处理/化学处理期间不会发生变性。而且，由于其尺寸小，可以通过将其附接到其它蛋白上而用作融合蛋白。具体而言，因为可以特异性地附接到高分子蛋白链上，它可以用作诊断试剂盒和药物递送物质。

23、本文所使用的术语“适配体”是指一种由特定类型的单链核酸(dna、rna或修饰的核酸)组成的多核苷酸，所述单链核酸自身具有稳定的三级结构，并且具有能够以高亲和力和特异性与靶分子结合的特性。如上所述，由于适配体可以像抗体那样特异性结合抗原性物质，但比蛋白更稳定并具有简单的结构，并且是由易于合成的多核苷酸组成，因此可以代替抗体来使用。

24、本发明第二方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括mir-130b的抑制剂，或klf4的激活剂。

25、在本发明中，术语“抑制剂”是指任何可降低mir-130b基因的稳定性、减少mir-130b有效作用时间、或抑制mir-130b基因的转录的物质，这些物质均可用于本发明。

26、进一步，所述的抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制物、化合物抑制物。

27、进一步，核酸抑制物包括shrna、sirna、dsrna、微小rna、反义核酸。

28、进一步，所述蛋白抑制物包括蛋白水解酶、蛋白结合分子。

29、在本发明中，术语“激活剂”是指任何可促进klf4表达的物质，促进klf4表达的物质的类型可以包括核酸、碳水化合物、脂类、小分子化合物、多肽、蛋白、多糖。

30、进一步，所述的激活剂包括klf4基因、klf4蛋白、促进型mirna、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

31、进一步，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。

32、术语“药学上可接受的载体”包括适用于制备所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括，但不限于，糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及根据配制人员的判断，组合物中还可以存在其他无毒相容的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

33、本发明第三方面提供了一种筛选治疗脑血管痉挛的药物的方法，所述的方法包括对细胞添加测试药物后或在对模型动物施用测试药物后的某个时期测量基因标志物的表达水平来测定测试药物治疗脑血管痉挛的效果，所述的基因标志物包括mir-130b、或klf4。

34、进一步，当mir-130b的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该测试药物作为治疗脑血管痉挛的药物。

35、进一步，当klf4的表达水平在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该测试药物作为治疗脑血管痉挛的药物。

36、进一步，所述的脑血管痉挛为蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉挛。

37、本发明第四方面提供了一种非治疗目的的促进细胞中klf4的表达水平的方法，所述的方法包括抑制细胞中mir-130b的表达水平。

38、进一步，所述的抑制细胞中mir-130b的表达水平包括向细胞添加mir-130b的抑制剂。

39、进一步，所述的抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制物、化合物抑制物。

40、进一步，核酸抑制物包括shrna、sirna、dsrna、微小rna、反义核酸。

41、进一步，所述蛋白抑制物包括蛋白水解酶、蛋白结合分子。

42、本发明第五方面提供了一种非治疗目的的调控细胞中p38/mapk信号通路相关蛋白的表达水平的方法，所述的方法包括向细胞添加mir-130b的抑制剂或klf4的激活剂，所述的p38/mapk信号通路相关蛋白包括pcna、mmp2、mmp3、mmp9、或p-p38。

43、进一步，向细胞添加mir-130b的抑制剂或klf4的激活剂，细胞中pcna、mmp2、mmp3、mmp9或p-p38的表达水平下调。

44、进一步，所述的抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制物、化合物抑制物。

45、进一步，核酸抑制物包括shrna、sirna、dsrna、微小rna、反义核酸。

46、进一步，所述蛋白抑制物包括蛋白水解酶、蛋白结合分子。

47、进一步，所述的激活剂包括klf4基因、klf4蛋白、促进型mirna、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

48、本发明第六方面提供了如下任一项所述的应用：

49、(1)本发明第一方面所述的试剂在制备诊断脑血管痉挛的产品中的应用；

50、(2)本发明第二方面所述的药物组合物在制备治疗脑血管痉挛的药物中的应用。

51、在本发明的上下文中，术语“诊断”包括判断受试者是否已经患有脑血管痉挛、判断受试者是否存在患有脑血管痉挛的风险、判断脑血管痉挛患者对药物治疗的反应性、或者判断脑血管痉挛患者的预后情况。

52、术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

53、进一步，所述的脑血管痉挛为蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉挛。

54、进一步，所述的产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

55、在本发明中，“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

56、“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是dna、rna或其中的任何排列。

57、在本发明中，试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

58、高通量测序平台是一种特殊的诊断脑血管痉挛的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知基因标志物的异常与脑血管痉挛相关也属于基因标志物的用途，同样在本发明的保护范围之内。

59、有益效果：

60、本发明首次通过体外和体内实验证明mir-130b通过靶向抑制klf4可能激活p38/mapk信号通路，从而在一定程度上促进sah后脑血管痉挛的发生。基于该研究结果，本发明为sah后脑血管痉挛的诊断和治疗提供了新方法。本发明还提供了一种筛选治疗sah脑血管痉挛的药物的方法。