磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒和提取方法与流程

本发明属于分子微生物学领域，具体涉及磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒和提取方法。

背景技术：

1、dna提取是分子生物学研究的一个重要环节，是几乎所有核酸检测的基础。传统的b族链球菌dna提取方法有物理破碎法、煮沸法、酚-氯仿抽提法、盐析法等。但是上述方法均存在一些缺点：(1)传统的提取方法需要反复的换管或离心、分液等操作，步骤繁琐，工作效率低，容易导致交叉污染，且自动化难以实现。(2)酚-氯仿抽提法需要使用有毒物质，对人体有害且易污染环境。(3)采用盐析法和煮沸法提取的dna纯度低。(4)物理破碎法操作较为繁琐，提取的dna纯度低且完整性差。

2、近几年，随着磁珠法提取试剂的推广，也有使用磁珠法提取b族链球菌dna的试剂盒上市，且逐步成为目前检验机构用来处理和提取b族链球菌dna的主要方法。但是现有的试剂盒存在以下缺陷：(1)需使用蛋白酶k或者溶菌酶或特定细菌裂解酶等酶组分，且所检测的样本量由于自动化设备配套耗材容积及试剂本身的限制，样本量仅为0～300μl，若要处理更大体积，仍需离心等繁琐的操作，在b族链球菌dna提取上，仅实现了一定程序上的自动化。(2)现有的磁珠法提取b族链球菌dna的试剂盒所能处理的样本量仅为0～300μl，对于b族链球菌这一容易呈链状分布的样本，成链状态有短有长，其菌液为非均一分布，导致现有磁珠法提取试剂单个样本的重复性较差。(3)虽然部分试剂使用双孔裂解，如公布号为cn111334502a的中国发明专利公开了一种快速提取b族链球菌核酸的方法，通过双孔裂解，使得样本量数量不仅仅局限于250μl，有利于获得更多的核酸，但仍然无法避免由于b族链球菌链状分布导致取样差异，从而造成无效取样。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单，且样本加入量大的磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒和提取方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒，包括菌清洗液、菌结合液、捕获微球溶液、裂解液、清洗液1、清洗液2和洗脱液；所述菌清洗液为0.1～2m的亚硝酸钠溶液；所述菌结合液包括1～3m乙酸和5～10m乙酸钠。

3、本发明采用的另一技术方案为：磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：使用菌清洗液将菌从采集工具上清洗下来，得到菌液，菌液经过手动或自动完成dna提取；

4、所述手动完成dna提取包括以下步骤：

5、s1：将菌液加入菌结合液，混匀后加入捕获微球溶液，再次混匀置于35～39℃下温浴8～12min，再磁吸1.5～2.5min后去除液体；

6、s2：加入裂解液，在63～67℃、1450～1550rpm的条件下裂解10min，随后磁吸2.5～3.5min后去除液体；

7、s3：加入清洗液1，震荡混匀后磁吸1.5～2.5min后去除液体；再加入清洗液2，震荡混匀后磁吸1.5～2.5min后去除液体；

8、s4：静置1.5～2.5min，加入洗脱液在63～67℃、1450～1550rpm的条件下洗脱，再磁吸2.4～3.5min，完成dna提取。

9、本发明的有益效果在于：本发明的dna提取试剂盒中清洗液和结合液配合，使得菌体暴露出抗体的结合位点与捕获微球结合，不经过离心等操作即可实现菌体的全部收集，可避免b族链球菌链状分布，增大了样本体积加入量。

10、本发明的dna提取方法，先使用菌清洗液提供水环境及盐离子浓度，以将b族链球菌从干拭子上清洗下来，形成菌液；再结合液中的组分与清洗液组分混合，使得悬浮在清洗液中的菌体暴露出抗体结合位点，与标记在磁性微球表面的抗体结合，形成b族链球菌-磁珠复合体，并在磁场的作用下，将b族链球菌-磁珠复合体与溶液分开，实现菌体富集；然后使用含有高浓度离序盐和表面活性剂的裂解液，以裂解和释放核酸；最后经过清洗和洗脱后，完成dna提取。

技术特征：

1.磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒，其特征在于，包括菌清洗液、菌结合液、捕获微球溶液、裂解液、清洗液1、清洗液2和洗脱液；所述菌清洗液为0.1～2m的亚硝酸钠溶液；所述菌结合液包括1～3m乙酸和5～10m乙酸钠。

2.根据权利要求1所述的磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒，其特征在于，所述捕获微球溶液包括磁珠，所述磁珠为单分散、超顺磁性的标记有羧基和硅羟基的纳米磁珠，且标记修饰有b族链球菌抗体；所述磁珠悬浮在乙醇溶液中。

3.根据权利要求1所述的磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括异硫氰酸胍、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、异丙醇、三羟甲基氨基甲烷和无菌去离子水，所述裂解液的ph值为5.5～8.5。

4.根据权利要求1所述的磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液1包括盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙醇和无菌去离子水，所述清洗液1的ph值为5.5～7.5。

5.根据权利要求1所述的磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液2包括氯化钠、乙醇、三羟甲基氨基甲烷和无菌去离子水，所述清洗液2的ph值为6.5～8.5。

6.根据权利要求1所述的磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括无菌去离子水或三羟甲基氨基甲烷溶液。

7.磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：使用菌清洗液将菌从采集工具上清洗下来，得到菌液，菌液经过手动或自动完成dna提取；

8.根据权利要求7所述的磁珠法b族链球菌dna提取试剂盒的提取方法，其特征在于，所述自动完成dna提取的具体步骤为：将清洗下来的菌液全量倒入已预分装好各组分的深孔板中，选择自动化提取程序运行，按程序运行结束后，所得产物即为提取好的核酸。

技术总结
本发明属于分子微生物学领域，具体涉及磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒和提取方法。该磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，包括菌清洗液、菌结合液、捕获微球溶液、裂解液、清洗液1、清洗液2和洗脱液。Gauge提取试剂盒中的清洗液和结合液配合，使得菌体暴露出抗体的结合位点与捕获微球结合，不经过离心等操作即可实现菌体的全部收集，增大了样本体积加入量。

技术研发人员：黄海峰,石青,李晓燕
受保护的技术使用者：泰普生物科学（中国）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15