一种用于启动子活性检测的慢病毒载体

本发明属于生物，涉及一种用于启动子活性检测的慢病毒载体。

背景技术：

1、荧光报告基因系统是研究启动子活性的重要方法，将目标启动子序列克隆至带有报告基因的载体上，目前研究中多使用瞬时转染的方法将启动子-报告基因载体，连同对照载体共转染至细胞中，给予刺激后检测报告基因的表达情况，以此来评价启动子活性。但是由于转染过程的不均一性，往往需要共同转染一个其他报告基因的载体作为对照，来评价转染的效率。在这个过程中需要检测两种报告基因，增加了检测成本和系统的不稳定性。并且对于一些难转染细胞，例如免疫细胞，转染效率比较低，不适合这种方法。因此开发一种可用于稳定转染的报告基因系统，可显著提高检测效率和数据的真实性。

2、慢病毒载体系统是常用于外源基因稳定表达的方法，对于难转染细胞借助于抗性基因的筛选，也可获得稳定转染的细胞。以hiv为代表的慢病毒基因组包括9个基因所构成，gag、pol、env表达病毒的结构蛋白，tat、rev调节基因表达，vif、vpr、vpu、nef为辅助基因。在9个基因的共同作用下可表达出具有感染和复制活性的慢病毒。

3、在科学研究中，为了避免产生具有复制活性的慢病毒，开发了具有感染活性的假病毒，将病毒骨架与结构蛋白和调节基因分别在不同的载体上表达。经过了三代的发展，已经开发出具有安全高效的慢病毒系统。在第一代中由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成：用疱疹病毒糖蛋白g替换包膜蛋白单独在质粒中进行表达，包装载体表达gag/pol以及各种辅助蛋白，带有目的基因的穿梭载体带有包装信号ψ及ltrs，可将目的基因包装在假病毒中；第二代中慢病毒载体中去除了辅助基因，在不影响病毒的滴度和转染能力的情况下，增加了载体的安全性；第三代载体中删除了5’-ltr的u3和3’-ltr的u3,去除了tat基因，使用cmv启动子以起始病毒基因组rna的转录，同时只保留了3个(gag、pol和rev)基因，因此第三代慢病毒载体系统更加安全。

4、由于第三代慢病毒载体中删除3’-ltr的u3区域，使用异源启动子融合的嵌合5'-ltr，使得整合到基因组中的序列无法独立进行rna的转录，因此更加安全。报告基因转录需要依靠待检测的目标启动子的驱动，更加真实的反应目标启动子的活性，降低报告基因的背景信号。

5、目前通常使用瞬时转染的方法来检测启动子的活性，然而对于一些难转染细胞比较困难，并且市场上在售的基于慢病毒系统的启动子活性检测载体多使用第二代慢病毒系统，背景很高。因此，需要寻找一种新的检测启动子活性的慢病毒载体。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种用于启动子活性检测的慢病毒载体。

2、第一方面，本发明提供了慢病毒载体，其依次包括pcdh载体骨架a、多克隆位点、报告基因a、报告基因b、驱动筛选标记基因表达的启动子和pcdh载体骨架b；

3、所述pcdh载体骨架b包括所述筛选标记基因，且该筛选标记基因位于所述驱动筛选标记基因表达的启动子下游；

4、所述pcdh载体骨架a为序列1第1-1933位；

5、所述pcdh载体骨架b为序列1第3866-8370位。

6、上文所述慢病毒载体中，

7、所述多克隆位点包括bstbi酶切识别位点、ecori酶切识别位点、sali酶切识别位点、xmai酶切识别位点、smai酶切识别位点和bamhi酶切识别位点；

8、所述报告基因a和所述报告基因b不同。

9、在本发明的实施例中，所述报告基因a具体为nluc基因(序列1第1986-2498位)；

10、所述报告基因b具体为copgfp基因(序列1第2595-3257位)；

11、所述筛选标记基因为puro基因(序列1第3866-4465位)；

12、所述驱动筛选标记基因表达的启动子为pgk(序列1第3337-3845位)。

13、上文所述慢病毒载体的核苷酸序列为序列表中序列1。

14、第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的慢病毒载体的方法，包括如下步骤：

15、1)制备目标片段和第三代慢病毒载体骨架；

16、所述目标片段包括第一方面中所述多克隆位点、所述报告基因a、所述报告基因b和所述驱动筛选标记基因表达的启动子；

17、所述第三代慢病毒载体骨架由序列1中第1-1933所示载体骨架a和序列1第3866-8370位所示载体骨架b组成；其中序列1第3866-4465位为筛选标记基因；

18、2)将所述目标片段和所述第三代慢病毒载体骨架连接，得到慢病毒载体。

19、具体为将所述目标片段连接到所述第三代慢病毒载体的两部分载体骨架之间，得到慢病毒载体，且所述目标片段中的驱动筛选标记基因表达的启动子驱动位于其下游的筛选标记基因的表达。

20、上文所述方法中，所述目标片段的核苷酸序列为序列1第1934-3865位。

21、上文所述方法中，在本发明的实施例中，

22、目标片段(mcs-nluc-p2a-copgfp-pgk片段)按照如下方法制备：以mcs-f、pgk-r为引物，用plvx-mcs-nluc-p2a-copgfp-pgk-puro为模板来扩增，得到mcs-nluc-p2a-copgfp-pgk片段。

23、上述plvx-mcs-nluc-p2a-copgfp-pgk-puro按照如下方法制备：先用pgk-f、plvx-r为引物，以plvx-metluc为模板，扩增plvx-mcs-pgk-puro载体骨架；使用nluc-f、gfp-r为引物，以pcdh-cmv-nluc-p2a-copgfp-t2a-puro，扩增的nluc-p2a-copgfp片段；再将plvx-mcs-pgk-puro载体骨架和nluc-p2a-copgfp片段无缝克隆，得到plvx-mcs-nluc-p2a-copgfp-pgk-puro。

24、上述第三代慢病毒载体骨架按照如下方法制备：以puro-f、pcdh-r为引物，用pcdh-cmv-flag-il10-ef1-copgfp-t2a-puro为模板来扩增，得到pcdh-puro载体骨架(由序列1中第1-1933所示dna分子和序列1第3866-8370位所示dna分子组成)；

25、第三方面，本发明提供了第一方面所述慢病毒载体或由第二方面方法制备的慢病毒载体在检测待测片段是否具有启动子活性中的应用；

26、或本发明提供了第一方面所述慢病毒载体或由第二方面方法制备的慢病毒载体在检测待测片段是否驱动报告基因a和报告基因b表达中的应用；

27、或本发明提供了第一方面所述慢病毒载体或由第二方面方法制备的慢病毒载体在检测启动子活性中的应用；

28、或本发明提供了第一方面所述慢病毒载体或由第二方面方法制备的慢病毒载体在比较启动子活性强弱中的应用。

29、上文中，所述报告基因a具体为nluc基因；

30、所述报告基因b具体为copgfp基因；

31、所述检测启动子活性为检测启动子是否驱动nluc基因和copgfp基因的表达。

32、第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒表达载体，为将待测片段插入第一方面所述慢病毒载体的多克隆位点，得到的载体。

33、上文所述待测片段为启动子或疑似启动子或具有驱动基因表达的功能的片段或疑似具有驱动基因表达的功能的片段，在本发明的实施例中，以ef-1α启动子为例。

34、第五方面，本发明提供了一种检测待测片段是否具有启动子活性的方法，包括如下步骤：

35、1)将待测片段插入第一方面所述慢病毒载体的多克隆位点，得到的载体；

36、2)检测所述载体是否表达报告基因a和报告基因b，若表达，则该待测片段具有启动子活性，若不表达，则该片段不具有启动子活性。

37、上文中，所述报告基因a具体为nluc基因；

38、所述报告基因b具体为copgfp基因；

39、上述表达为与第一方面所述慢病毒载体相比，nluc基因和copgfp基因的表达量均提高。

40、上文所述方法中，所述检测载体是否表达报告基因a和报告基因b为将所述载体转入细胞中，得到转染后细胞，再检测所述转染后细胞中报告基因a和报告基因b基因的表达。

41、上文中，所述报告基因a具体为nluc基因；

42、所述报告基因b具体为copgfp基因；

43、上述检测转染后细胞中nluc基因和copgfp基因的表达的方法为如下1)-3)：

44、1)pcr检测nluc基因和copgfp基因是否阳性；

45、2)luciferase assay方法检测nluc活性；

46、3)荧光显微镜检测copgfp基因是否表达。

47、本发明制备的慢病毒载体，其可以评价启动子或疑似启动子或具有驱动基因表达的功能的片段或疑似具有驱动基因表达的功能的片段活性的；该载体具有多个多克隆位点用于待测基因的插入，使用第三代慢病毒载体骨架，更安全，包装出的假病毒可实现一些难转染细胞的稳定转染更真实的反应启动子活性，具有较低的背景，具有nluc和cogfp双重标记，有利于启动子活性的检测和评价。