一种长松萝内生真菌YAFEF048菌株及其制备方法和应用

本发明涉及微生物，尤其涉及一种长松萝内生真菌yafef048菌株及其制备方法和应用。

背景技术：

1、耐药性病原体的传播和发展，感染性疾病成为一个全球性问题，严重威胁公共卫生安全(mel et al.,,2013；gupta et al.,2015)。自青霉素被发现以来，以青霉素为代表的抗生素为人类健康做出了巨大贡献，抗生素在防治耐药性细菌病原体感染方面有着不可替代的作用(朱永官等,2015；姚裕群等,2020)。如今，抗生素的大量使用导致细菌耐药性问题日趋严重(李福长等,2014；程古月等,2014)，传统抗生素的研发已进入瓶颈，以控制耐药菌感染为主要目标的新结构、新靶点和新机制的新型抗菌药物的研究及开发变得极为迫切。

2、有研究表明,植物内生真菌的代谢产物中大多存在抗菌活性物质(马养民等,2010)，次生代谢产物结构主要包含生物碱、聚酮、萜类、黄酮等类型(李杨等,2010；柯春林等,2015)，具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、杀虫、抗糖尿病和免疫抑制等功能(华梅等,2018；gao et al.,2018)，这些种类繁多的抗菌活性物质有许多还是未开发的新物质。因此,植物内生菌因具有作为新型抗菌药物筛选源的巨大潜力，利用植物内生真菌生产活性物质可持续利用资源，减少对自然资源的破坏，缓解因自然资源匮乏等问题带来的植物源抗菌化合物开发的困难。目前已经有学者对这方面进行了研究，姚裕群等(2020)等对越南槐(sophora tonkinensis)内生菌刺盘孢trph-35的进行鉴定和抗菌活性检测。华梅等(2018)对白木香(aquilaria sinensis)茎秆和叶片中分离的10株植物内生真菌经行形态与分子鉴定，并对初提物经行致病细菌的抑菌活性检测。

3、长松萝(u.longissima a ch)为地衣类松萝科usneaceae松萝属植物，松萝属地衣药用历史悠久，药用部位为全草(mahadik et al.,2009；mafole et al.,2016；王静等,2017)。目前，已经从长松萝中提出许多具有抗癌、抗炎症、抗菌等生物活性的化合物，比如松萝酸(usnic acid)，拉马酸(ramalic acid)，巴尔巴地衣酸(barbat icacid)(su etal.,2006；odabasoglu et al.,2006；bayir et al.,2006)。本研究通过分离筛选长松萝的共生菌，得到一株具有抗菌活性的真菌yafef048，通过实验发现，yafef048菌液体提取物对蜡样芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、溶血性葡萄球菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、大肠埃希菌等细菌具有较好的耐药性，为研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。

4、目前，缺乏一株耐药性强的长松萝内生真菌yafef048及其应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供了一株耐药性强的长松萝内生真菌yafef048及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明的一株长松萝内生真菌yafef048菌株，该菌株为长松萝内生真菌yafef048 dothichiza sp.；保藏名称为疡壳孢属；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期是2021年11月1日；保藏编号:cctccm20211345。

3、进一步地，所述的长松萝内生真菌yafef048的its基因序列为seq idno.1所示的核苷酸序列。

4、进一步地，真菌在pda培养基上生长良好，菌落表面呈绒毛状，生长前期菌丝是白色呈放射状向周围生长，生长后期菌丝较密集，且菌层较厚，颜色微微泛红，菌落呈规则的圆形状。

5、本发明所述的长松萝内生真菌yafef048菌株制备的长松萝内生真菌yafef048菌剂。

6、进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：

7、(a)所述的长松萝内生真菌yafef048的培养物的发酵液提取物；

8、(b)所述的长松萝内生真菌yafef048细胞的超声裂解上清；

9、(c)所述的长松萝内生真菌yafef048细胞的超声裂解沉淀。

10、本发明所述的长松萝内生真菌yafef048菌株的制备方法，包括如下步骤：

11、(1)取长松萝样品用无菌水冲洗干净，(无菌操作)用剪刀剪成0.5cm×0.5cm的小块，先用1l无菌水冲洗样品，再用75％乙醇消毒1min(期间不断震荡)，后用无菌水冲洗3-4次，用无菌滤纸吸干样品表面多余的水分，晾干备用。

12、(2)将处理好的样品，放入2ml的离心管中，加入500μl的超纯水，然后在细胞破碎匀浆机中180rpm震荡2min破碎，将破碎液按十分之一、百分之一、千分之一进行稀释，取200μl子实体悬浮液涂抹在pdakas抗细菌培养基上(pdakas抗细菌培养基：马铃薯200g/l+葡萄糖20g/l+琼脂15g/l+氨苄青霉素50ug/ml+卡那霉素50ug/ml，将接好的培养基放置于26℃恒温培养箱中培养。

13、(3)待培养基中长出的菌丝，在显微镜下把长出的菌丝转接的到pda培养基上培养，持续观察10d后，将所挑取的菌株进行后续分子鉴定后得到长松萝内生真菌yafef048菌株。

14、本发明长松萝内生真菌yafef048菌剂的制备方法，包括如下步骤：

15、(1)加入1ml的pg液体到2ml的离心管中，并在每个离心管放3颗灭菌好的钢珠，然后将已长成型的长松萝内生真菌yafef048菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90s，然后将破碎液分别接种500ul到每个装有pg液体培养基的锥形瓶中，置于28℃，转速为150r·min-1的摇床中培养10d。

16、(2)培养物菌丝体提取

17、发酵培养完成后，得到的真菌菌丝体及培养液，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中加入乙酸乙酯(1:1)摇匀6min，超声30min后静置12h，将分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，获得长松萝内生真菌yafef048培养的发酵液提取物。

18、进一步地，所述的液体发酵培养基为pg液体培养基。

19、进一步地，所述的pg液体培养基由如下组分组成：马铃薯浸粉5g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，七水硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，维生素b10.1g/l，纯净水1l，培养基分装至100ml锥形瓶。

20、本发明所述的长松萝内生真菌yafef048菌剂在制备抗细菌药物中的应用。

21、有益效果：本发明对多种致病细菌有较好的抑制作用，为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。

22、与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明用破碎子实体后破碎液涂板的方法来分离共生菌，比起常用的分离方法操作简便、效果显著。

23、(2)本发明提供了一种新的疡壳孢属dothichiza sp.yafef048菌株，申请人发现该菌株培养物的提取物具有广谱抗细菌活性，其活性物质和抗菌机制可为新药研发提供新的途径。